Ученые имеют информации больше чем когда-либо, о том, как различаются клетки, но клетки по-прежнему не поддаются простой группировке.
Проблема типов клеток стала очевидной для геномного биолога Джейсона Буэнростро в 2013 году. Он изучал клеточную линию, полученную от больного раком человека, и пытался определить, как ДНК расположена в ядре. По его мнению, все клетки должны были быть практически идентичными. Но чем больше Буэнростро смотрел на ДНК, тем больше различий находил в ее упаковке. «Я понял, что, вероятно, существуют сотни вариантов», - вспоминает Буэнростро. Это и другие исследования подтолкнули его к выводу, что «каждая клетка - это как уникальная снежинка». И этот вывод существенно осложнил его исследования того, как некоторые раковые клетки развивают устойчивость к медикаментам. Для Буэнростро, который сейчас работает в Гарвардском университете, это означало, что «все эти клетки-снежинки на самом деле могут быть важными».
Несмотря на их индивидуальность, существуют прагматические причины объединять похожие клетки в группы. «Определение типов клеток имеет решающее значение для понимания новых биологических явлений, выяснения глубинных механизмов и определения целей терапии», - говорит Чжан Чжан, биоинформатик из Пекинского института геномики при Китайской академии наук.
Проекты по созданию огромных атласов клеток уже приносят массу данных и позволяют понять суть заболеваний. С середины 2010-х годов ученые, занимающиеся классификацией клеток, в значительной степени опираются на секвенирование РНК отдельных клеток - метод, который позволяет определить гены, включенные в каждой клетке, и сгруппировать клетки со схожим профилем. В рамках многонационального сотрудничества проекта Human Cell Atlas (Атлас клеток человека), запущенного в 2016 году, было проанализировано более 90 миллионов клеток от более чем 11 000 человек в рамках постоянной работы по созданию 18 различных атласов и опубликовано более 440 исследований.
Но за этим прогрессом скрывается обманчиво простой вопрос: что же такое тип клеток? «Тип клеток - это группа клеток, которые похожи друг на друга и отличаются от других групп клеток», - говорит нейробиолог Хонкуи Зенг, директор Института Аллена по изучению мозга. Но даже такое определение оставляет много возможностей для интерпретации: насколько похожи? В чем состоит различие? Спросите дюжину исследователей, и вы получите столько же разных ответов. В самом деле, когда в 2017 году журнал Cell Systems провел подобный опрос, 15 исследователей предложили совершенно разные варианты, указывая на историю развития, молекулярный профиль, форму или функцию в качестве возможных идентификаторов. «Дебаты могут быть весьма жаркими, - говорит Буэнростро.
Возможно это связано с тем, что этот вопрос затрагивает суть представлений ученых об основной единице жизни. Некоторые исследователи отвергают мнение о том, что клетка - это простое сложение экспрессии генов, как предполагают атласы, основанные на секвенировании РНК. Другие утверждают, что необходимо учитывать также и то, как клетка проходит через различные состояния с течением времени. Но большинство сходится в одном, комментирует Барбара Тройтлейн, биолог многоклеточных систем из Швейцарского федерального технологического института. «Все согласны с тем, что это чрезвычайно сложно».
Подобная борьба за ключевые определения вряд ли уникальна для клеточной биологии: таксономисты веками бились над вопросом «что такое вид?», а генетикам пришлось столкнуться с проблемой «что такое ген?», когда догма о том, что один ген производит один белок, начала разрушаться несколько десятилетий назад. На протяжении всей истории клеточной биологии списки клеточных деталей появлялись в разных вариантах, отражая преобладающую технологию того времени. Около 1900 года микроскопия стала царицей биологии и такие исследователи как испанский гистолог Сантьяго Рамон-и-Кахал зарисовали клетки и начали группировать их по внешнему виду. Например, некоторые обычные, звездчатые клетки мозга стали называть астроцитами, или звездообразными клетками.
В результате молекулярно-биологической революции, которая набрала обороты в середине 1990-х годов, ученые научились классифицировать клетки на основе ограниченного набора молекулярных маркеров. Так астроциты стали клетками, вырабатывающими глиальный фибриллярный кислый белок, или GFAP, который легко визуализировать, окрашивая клетки или помечая ген GFAP зеленым флуоресцентным белком. Затем появился метод секвенирования РНК единичных клеток, впервые опубликованный в 2009 году. Сегодня клеточные картографы могут определять астроциты по множеству РНК, которые они экспрессируют, - подход, который имеет параллели с использованием сравнительной геномики для понимания эволюции видов. Но ни один из этих инструментов не говорит о том, что делают астроциты - поддерживают нейроны и синапсы.
Нейроны Пуркинье (бирюзовые) в мозжечке - области мозга, контролирующей движение и другие функции.Фото: Thomas Deerinck, NCMIR/Science Photo Library
Не так-то просто сгруппировать клетки по функциям. По мнению Энн Уэст, нейробиолога из Университета Дьюка, один из типов клеток, которые часто классифицируются по функциональному признаку, - это нейроны, которые часто подразделяются по выделяемым ими химическим веществам (например, дофамину или серотонину). Но многие нейроны производят одни и те же нейромедиаторы, например, в середине 2000-х годов ученые спорили о том, сколько типов нейронов производят нейромедиатор ГАМК; оценки варьировались от четырех до ... многих. Уэст ожидает, что продолжающаяся работа с отдельными клетками и экспрессией РНК в мозге поможет прийти к единому мнению.
Тем не менее, функция клетки может быть в принципе лучшим способом определить тип клетки, утверждает Джошуа Санес, нейробиолог из Гарварда. А одной из функций клетки, добавляет Тройтлейн, является ее реакция на окружающую среду. В живой ткани клетки постоянно подвергаются воздействию сигналов, которые могут повлиять на них, например, метаболитов, гормонов или патогенов. «По-настоящему понять, к какому типу относится клетка, можно только после того, как вы узнаете, как она на это реагирует», - говорит Тройтлейн. «Все эти состояния вместе и скажут вам, что она собой представляет». Она предполагает, что в будущем атласы клеток должны включать в себя информацию о том, как клетки реагируют на подобные изменения например, как клетки могут изменять траекторию своего развития в ответ на лечение лекарственными препаратами.
К сожалению, клеточные реакции и функции не очевидны для многих типов клеток и могут быть преходящими характеристиками. Их изучение требует много времени, а клетки часто меняют свою функцию, когда их переносят из целого организма в лабораторные условия для целенаправленного изучения. Это заставляет исследователей принимать более практичные критерии типизации клеток и объясняет доминирование стандартизированных молекулярных методов - в основном секвенирования РНК одиночных клеток, а также метода, разработанного Буэнростро и другими исследователями для изучения упаковки ДНК, и пространственных методов, которые связывают эти молекулярные маркеры с местом клетки в ткани. Объединив эти подходы, «мы действительно по-новому определили, что такое типы клеток», - полагает Сара Тайхманн, геномный биолог и биофизик из Кембриджского университета и сопредседатель проекта Human Cell Atlas.
Этот новый молекулярный подход позволил получить захватывающие результаты, которые обещают переписать многое из того, что клеточные биологи знают об организме. Так, если раньше ученые считали, что в человеческом организме существует около 200 типов клеток, то в прошлом году Зенг и коллеги выявили более 5 000 кластеров РНК - а значит, и потенциальных типов клеток - только в коре головного мозга мыши.
Целенаправленные усилия также позволяют обнаружить новые типы даже в хорошо изученных тканях. Например, около 10 лет назад Санес и его коллеги начали изучать типы клеток в сетчатке мыши с помощью секвенирования РНК отдельных клеток. В то время ученые предполагали, что их около 65; новый анализ выявил не менее 130. До этого исследователи, вероятно, пропускали более редкие типы или очень похожие, которые молекулярные методы могли различить, предполагает Санес. Сейчас Санес и его коллеги сравнивают атласы сетчатки разных видов. Атласы клеток напрямую влияют и на медицинские исследования. Две независимые исследовательские группы обнаружили редкий новый тип клеток, который потенциально может быть вовлечен в развитие муковисцидоза; другая группа профилировала и картировала кардиостимулирующие клетки в сердце.
Во время пандемии COVID-19 многие исследователи обратились к изучению вируса SARS-CoV-2, рассказывает Авив Регев, вычислительный и системный биолог, руководитель отдела исследований и ранних разработок биотехнологической компании Genentech, который является соведущим Атласа клеток человека. В ходе исследований были выявлены различные типы клеток, восприимчивых к инфекции, и показано, как их клеточные реакции отражают или расходятся с реакциями при других заболеваниях. Регев говорит, что компания Genentech уже использует данные клеточного атласа при разработке лекарственных препаратов. Например, одна группа исследователей тестирует препарат для лечения легочных заболеваний, который связывается с рецептором, обнаруженным в клетках легких. Но изучив атлас клеток, исследователи обнаружили тот же рецептор в большем количестве клеток, расположенных в кишечнике, что имеет отношение к воспалительным заболеваниям кишечника. Это заставило их испытать тот же препарат для лечения этого заболевания. Без этого ресурса они никогда бы не заметили сходства, уверен Регев.
Помимо поиска лекарств и желания провести инвентаризацию организма, вопрос о типе клеток затрагивает более глубокую проблему: что является основной единицей жизни? «Я бы сказал, что в целом существует два лагеря ученых», - говорит Итай Янаи, системный биолог из Нью-Йоркского университета. «Один лагерь рассматривает клетки, а другой - гены».
Один из тех, кто твердо придерживается клеточной ориентации, - Альфонсо Мартинес Ариас, биолог, специализирующийся на развитии из Каталонского института исследований и перспективных разработок в Барселоне, Испания. Он говорит, что секвенирование РНК одиночных клеток создает геноцентричный взгляд, который отвлекает ученых от других вопросов. «Я думаю, что клетка - это нечто большее, чем совокупность содержащихся в ней РНК», - считает Ариас. Например, когда он выращивает клетки для моделирования раннего эмбриона, профили РНК в двухмерных культурах мало отличаются от профилей в трехмерных органоидах, говорит он, хотя трехмерные версии имеют совершенно другую структуру и организацию.
Однако для таких ученых, как Янаи, гены являются основной единицей жизни, а клетки - проявлением этих генов. Поэтому каталогизация типов клеток по РНК имеет смысл: «Скажите мне, какие гены включены, и я скажу вам, какой это тип клеток», - говорит он. Например, по его словам, клетки кожи меланоциты, вырабатывающие пигмент, экспрессируют определенный «меланоцитарный модуль» генов.
Ворсинки в тонком кишечнике, которые помогают всасывать питательные вещества из пищи. Фото: Thomas Deerinck, NCMIR/Science Photo Library
Другой критерий для определения типа клетки - это физическое состояние генома в ядре: как геном образует петли и витки, оставляя одни гены доступными, а другие закрытыми, и определяя, какие гены доступны для транскрипции. Но даже такое расположение генома контролируется другими генами и белками, расположенными "выше по течению". Можно ли считать эти регуляторные молекулы истинной основой типов клеток? Гюнтер Вагнер, эволюционный биолог из Венского университета, считает, что да.
У Вагнера и его коллег есть теория: типы клеток контролируются большими комплексами транскрипционных факторов и других молекул, которые называются «основной регуляторный комплекс», или CoRC. Этот большой клубок взаимодействующих регуляторов дергает за ниточки ДНК, включая одни гены и подавляя другие, и таким образом определяет расположение хроматина, профиль РНК - и тип клетки. По словам Вагнера, CoRC были определены для нескольких типов клеток, таких как нервные клетки и клетки крови, но пока неясно, насколько универсальна эта концепция. Он подозревает, что CoRC определяют более короткий список типов клеток, чем кластеры, основанные на анализе отдельных клеток.
Что касается нынешнего внимания к секвенированию РНК, Тайхманн признает, что критика не лишена оснований. «Конечно, тип клетки - это не только профиль РНК», - говорит она. Она отмечает, что в Атлас клеток человека планируется включить различные методы типирования клеток; РНК-анализ был лишь первым, который стал доступен. По ее словам это очень важно, поскольку РНК отражает другие аспекты биологии клетки, включая расположение хроматина и набор белков.
Типы клеток часто описывают в соответствии с их нынешней принадлежностью. Но прошлое и будущее клетки не менее важны, даже клетки с кажущейся стабильной идентичностью могут превратиться в различные типы - например в иммунные клетки, которые активизируются для борьбы с инфекцией, или даже стать раковыми при определенных условиях.
Прошлое клетки, конечно, представляет большой интерес для биологов, изучающих, как одна клетка делится и развивается, чтобы создать сначала эмбрион, а затем целое существо. Именно поэтому окончательное представление типов клеток должно представлять собой древовидную структуру, уходящую корнями в первую клетку организма и заканчивающуюся зрелыми типами на кончиках ветвей, утверждает Джей Шендур, генетик развития из Университета Вашингтона в Сиэтле. Перечень деталей в атласе, по его словам, «не уделяет должного внимания концепции времени и понятию непрерывности».
Исследователи начинают создавать данные, которые лягут в основу таких деревьев. Например, в исследовании, проведенном в этом году, Шендур и коллеги отслеживали транскриптомы эмбрионов мыши от раннего развития до рождения и далее. Они обнаружили значительные изменения в РНК, экспрессируемой в клетках в течение часа после рождения, вероятно, потому, что животным пришлось адаптироваться к жизни вне утробы матери. Однако отслеживание типов клеток по линиям развития имеет свои проблемы. Бывают редкие случаи, когда типы, которые кажутся идентичными, могут развиваться по разным траекториям. И пока неясно, как классифицировать промежуточные формы.
Также необходимо учитывать такое переходное свойство клетки как ее состояние. Тип клетки может оставаться неизменным, в то время как ее состояние радикально меняется: скажем, от только что родившейся до готовящейся к следующему делению клетки или от покоящейся до активированной, поэтому отличить непостоянные состояния клеток от настоящих типов клеток может быть очень сложно. Если разные технологии не классифицируют клетки одинаково, а каждая клетка - это индивидуальность на самом тонком уровне, то что же такое тип клетки? Это понятие все еще кажется расплывчатым, но так оно и должно быть, считает Аллон Клейн, системный биолог из Гарвардской медицинской школы. Он говорит, что это понятие может быть одновременно и «чрезвычайно полезным, и плохо определяемым».
Это потому, что в конечном итоге не существует простой истины, природа не создала аккуратного списка деталей, как это сделал бы человеческий инженер, и любые попытки разграничить типы в некотором смысле искусственны.
То же самое можно сказать и о попытках таксономистов определить виды: этот вопрос никогда не исчезал, отмечает Клейн, но ответы на него менялись по мере поступления генетических данных. Клейн считает, что нечто подобное произойдет и в клеточной биологии.
Исследователи уже придумывают более тонкие способы определения и учета клеточных вариаций. Буэнростро и Регев стали рассматривать клетки не столько как представителей определенного типа, сколько как совокупность индивидуальностей, основанных на модулях или процессах, которые данная клетка выполняет в определенный момент времени. Так, клетка может выполнять, скажем, стабильную программу «фибробласт» с наложением состояний «активировать для восстановления раны» и «деление клетки».
Модули, которые важны для конкретного исследователя, будут зависеть от его интересов и перспектив. Вот почему метафора клеточного «атласа» так подходит. Как географический атлас объединяет природные особенности, политические границы и другие понятия, так и клеточные атласы могут объединить различные версии клеточной идентичности - независимо от точки зрения пользователя и того, куда он направляется.
