microbius
РОССИЙСКИЙ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЙ ПОРТАЛ
Поиск
rss

ООО "АЛИФАКС"

ИНН 7718314415

ID 2Vtzqx7tLnC

Реклама

ООО "АЛИФАКС"

ИНН 7718314415

ID 2VtzqwzYS9e

Реклама

ООО "АЛИФАКС"

ИНН 7718314415

ID 2VtzqvtsLHv

Реклама

Главные новости

slider-image

Новая миниатюрная платформа для ПЦР в реальном времени MOLECULAR MOUSE (производитель Alifax, Италия). Подборка аннотаций статей.

Anna Marzucco et al. Оценка эффективности нового диагностического теста для прямого обнаружения РНК SARS-CoV-2 с использованием портативной системы MOLECULAR MOUSE. Предпосылки     Диагностика COVID-19 в значительной степени зависит от молекулярных анализов с коротким сроком выполнения. Большинство диагностических наборов для выявления генома SARS-CoV-2 требует наличия квалифицированного персонала, большого количества приборов и рабочих процессов, которые могут быть выполнены только в высокоспециализированных лабораториях, что подразумевает высокую стоимость и задержки в проведении теста.     Мы оценили клиническую эффективность теста MOLECULAR MOUSE (MM) DIRECT COVID-19 с помощью системы MOLECULAR MOUSE, инновационного миниатюрной платформы для ПЦР в реальном времени, для выявления РНК SARS-CoV-2 непосредственно из оро/назофарингеальных мазков примерно за один час. Тест состоит из раствора для лизиса раствора для простой подготовки образца и готового к использованию картриджа Lab-On-Chip содержащий все реагенты для специфического обнаружения вирусного ORF1b и гена нуклеокапсидного и гена нуклеокапсидного белка (N1 и N2).     Целью исследования была оценка ММ DIRECT COVID-19 в сравнении с клинико-диагностическими характеристиками AllplexTM SARS-CoV-2 (Seegene), референсным методом RT-PCR, который регулярно используется в нашей лаборатории. Методы     Оценивались 689 свежих и замороженных оро/назофарингеальных мазков (собранных в течение 48 ч от начала симптомов) положительных и отрицательных пациентов с COVID-19. Образцы были собраны в период с 23/08/2021 по 07/10/2021. Анонимизированные образцы, отобранные с различной вирусной нагрузкой, были проанализированы одновременно с помощью MM DIRECT COVID-19 и референсным методом. Остаточные образцы мазков загружались на платформу MOLECULAR MOUSE для валидационного исследования в соответствии с инструкциями производителя.  Результаты     Результаты теста MM DIRECT COVID-19 на 689 образцах (247 положительных и 442 отрицательных на Allplex SARS-CoV-2), показали 94,33% чувствительности (233/247) и 99,32% специфичности (439/442) по сравнению с референсным методом (табл. 1). Все 14 ложноотрицательных результатов были получены при высоком значении Ct (между 30-36), что указывает на низкую чувствительность теста только в образцах с низкой вирусной нагрузкой.  Выводы     Мы продемонстрировали, что тест MM DIRECT COVID-19 является точным для подтверждении диагноза SARS-CoV-2. Даже менее опытные пользователи могут выполнить егопростой рабочий процесс и получить результаты примерно за один час. В заключение следует отметить, что мы провели клиническое обоснование быстрого, специфичного и простого в использовании теста, который может способствовать децентрализации тестирования на SARS-CoV-2 в небольших неспециализированных подразделениях (т.е. в клиниках неотложной помощи), в том числе в развивающихся странах. Источник: Постерная сессия на конференции ECCMID 2022, Лиссабон, Португалия. Vittorio IvagneIvagnes et al. Прямое обнаружение генов резистентности к ß-лактамам из положительной культуры крови с помощью чипа для определения резистентности к грамотрицательным бактериям (система Molecular Mouse).    Инфекция кровотока (ИК) - серьезное заболевание, которое может привести к генерализованной инфекции, множественной органной недостаточности и смерти. Быстрая идентификация возбудителя инфекции в положительных культурах крови (КК) (и их возможных маркеров резистентности) имеет решающее значение для своевременного начала эффективной антибиотикотерапии.    По данным Европейского центра профилактики и контроля заболеваний, в 2021 году наиболее резистентными к одному или нескольким классам антибиотиков были следующие виды бактерий: E. coli (39,4%), K. pneumoniae (11,9%). β Лактамы являются одними из наиболее используемых препаратов для лечения ИК, вызванных грамотрицательными бактериями, однако резистентность к этим антимикробным препаратам выросла за последние десятилетия, представляя собой всемирную клиническую проблему. Различные коммерческие тесты нуклеиновых кислот для диагностики ИК могут сократить время идентификации генов резистентности и имеют дополнительную ценность для принятия решений о рациональном использовании антибиотиков, сокращая время до начала соответствующей и оптимальной антибиотикотерапии.    Мы оценили эффективность платформы Molecular Mouse (производитель Alifax) с чипом для определения резистентности грамотрицательных бактерий (GNR) для выявления 9 генов резистентности к β-лактамазам blaIMP, blaCMY 2, группа blaCTX M 1\9, blaKPC, blaNDM, blaOXA-23 подобные, blaOXA-48 подобные, расширенные бета-лактамазы blaSHV, blaVIM) непосредственно из положительной культуры крови (ПКК). Методы   Для оценки чипа GNR мы использовали 4 вида бактерий (K. pneumoniae, P. aeruginosa, E. coli, A. baumannii) с общим количеством 60 образцов и 74 генами резистентности. Мы использовали архивные образцы из положительных КК на вышеупомянутые гены резистентности по 1,5 мл, смешанные со 100 мкл диметилсульфоксида и хранившиеся при 80 С, которые были предварительно исследованы с помощью системы BacTAlert (bioMérieux).     Кроме того, мы дополнили исследование положительными симулированными КК, чтобы увеличить количество генов резистентности для анализа. Для получения симулированных КК были взяты свежие колонии грамотрицательных бактерий, выросшие на чашках с агаром Макконки и суспендированные в фосфатном забуференном солевом растворе и инокулированы во флаконы КК с 8 мл консервированной человеческой крови. Инокулированные флаконы были инкубированы в системе BacTAlert до получения положительного сигнала. 200 мкл бульона положительных КК анализировали с помощью чипа GNR в соответствии с инструкциями производителя и результаты были получены через 1 ч. Результаты анализа GNR сравнивали с результатами ПЦР-амплификации и секвенирования субкультивированных изолятов в качестве референсного метода. Результаты   Всего в исследование было включено 58 положительных КК (56 мономикробных и 2 полимикробных). Анализ GNR правильно идентифицировал 74 (100%) из 74 β-лактамаз из 60 микроорганизмов, включая CMY (n=10), CTX M (n=16), KPC (n=13), NDM (n=9), OXA 23 (n=14), OXA 48 (n=5), ESBL SHV, (n=1), IMP (n=1) и VIM (n=5). Таблица 1. Профили генов антимикробной резистентности видов микроорганизмов включенных в исследование. Выводы   Эти предварительные данные свидетельствуют о потенциальной целесообразности использования чипа GNR в качестве полезной альтернативы фенотипическому тестированию для быстрого выявления маркеров резистентности и могут стать важным подспорьем в оптимальном ведении пациентов в критическом состоянии. Необходимо увеличить количество образцов и провести дальнейшие исследования для более точной оценки эффективности. Источник: Анналы Università Cattolica del Sacro Cuore Rome (Italy), 2022. Vittorio Ivagnes et al. Быстрая идентификация видов Candida из положительных культур крови с помощью молекулярного анализа на картридже lab-on-chip. Задачи:   Кандидемия, в частности связанная с неальбикансными видами Candida, является причиной значительной заболеваемости и смертности, а также увеличения расходов на здравоохранение, связанных с длительным пребыванием в стационаре. В связи с продолжающейся тенденцией к увеличению числа вспышек Candida auris и C. parapsilosis своевременная идентификация видов Candida в положительных культурах крови приобретает решающее значение для ведения пациентов и остается сложной задачей.    Целью настоящего исследования была оценка недавно разработанной платформы Molecular Mouse (производитель Alifax S.r.l.) на чипе в режиме реального времени для выявления клинически значимых видов Candida непосредственно из положительных культур крови. Материалы и методы:   Мы оценили анализ на чипе Yeast Blood (YBL) в сочетании с собственным протоколом выделения ДНК на 106 положительных культурах крови (КК) (63 симулированных и 43 реальных КК). В частности, сначала анализ был проведен на 7 смоделированных КК, включающих каждый из следующих видов Candida: C. albicans, C. glabrata, C. parapsilosis, C. tropicalis, C. krusei, C. auris, C. guillermondii, C. lusitaniae и C. dubliniensis. Затем анализ был проведен на 43 реальных положительных КК и сравнен с результатами, полученными с помощью MALDI-TOF-идентификации. Результаты:   Молекулярный анализ на чипе в режиме реального времени позволил нам идентифицировать все виды Candida, инокулированные в симулированных положительных КК, за исключением C. lusitaniae, менее чем за два часа. Что касается реальных положительных КК, система смогла обнаружить 19 C. albicans, 13 C. parapsilosis, 9 C. glabrata и 2 смешанные КК C. albicans плюс C. parasilosis в полном соответствии с идентификацией с помощью масс-спектрометрии MALDI-TOF. Выводы:   Наши результаты показывают, что молекулярный анализ с помощью картриджа lab-on chip может быть надежным и быстрым методом идентификации видов Candida в положительных КК. Дальнейшие эксперименты позволят оценить эффективность анализа и лучше определить его роль в рабочем процессе диагностической лаборатории. Рис. 1. Основные этапы методики выделения ДНК Candida. Источник: Trends in Medical Mycology, 2022. Более подробно о системе Molecular Mouse - в нашем каталоге.
slider-image

Технологии секвенирования нового поколения и другие технологии секвенирования в диагностической микробиологии и диагностике инфекционных заболеваний (полный текст статьи)

За последние несколько десятилетий использование технологий секвенирования следующего поколения (NGS) в клинической диагностике расширилось.     Технологии NGS (next generation sequencing) позволяют проводить массовое параллельное секвенирование миллионов фрагментов ДНК с высокой пропускной способностью. В области диагностики генетических заболеваний и рака эти технологии стали золотым стандартом диагностики. Только в последнее десятилетие, когда эти технологии NGS стали более доступными, их использование в лаборатории клинической микробиологии стало реальностью.    Современные технологии NGS могут быть использованы в трех различных областях клинической микробиологической лаборатории:  - секвенирование всего генома (WGS- whole genome sequencing),  - целевое секвенирование метагеномов и  - метагеномное секвенирование методом "дробовика".  В данном обзоре мы проанализируем эти три области применения и представим исчерпывающую информацию о том, как они используются в настоящее время в здравоохранении, фундаментальных исследованиях и лабораториях клинической микробиологии. Эти приложения нелегко внедрить в лабораторию, поэтому мы подчеркиваем важные факторы, которые необходимо учитывать при внедрении этих технологий. Тем не менее, эти технологии уже изменили ландшафт обычной лаборатории клинической микробиологии, и мы обсуждаем, что, по нашему мнению, возможно для этих технологий в диагностике инфекционных заболеваний в ближайшие 5 лет.(Статья опубликована в 2022 г. - прим.пер.). Эволюция технологий секвенирования    За последние 60 лет технологии секвенирования стремительно развивались, начав с секвенирования первого поколения и развившись до современных технологий секвенирования третьего поколения (табл. 1). Зарождение секвенирования первого поколения произошло одновременно, когда Фредерик Сэнгер и Аллан Максам и Уолтер Гилберт опубликовали свои протоколы, описывающие способы секвенирования ДНК.     Метод секвенирования Максама-Гилберта был основан на химическом разрушении, когда радиомеченную ДНК обрабатывали различными химическими веществами, чтобы разорвать цепь на определенных основаниях. Затем эти фрагменты прогоняли в полиакриламидном геле, чтобы определить положение интересующего нуклеотида. Сэнгер предложил метод обрыва цепи, который предполагает использование химических аналогов дезоксинуклеотидов (dNTPs), известных как дидезоксинуклеотиды (ddNTPs), которые предотвращают дальнейшее удлинение цепи ДНК. Метод включает четыре параллельные реакции с ddNTPs, которые проводятся в полиакриламидном геле для интерпретации того, какое основание присутствует в нуклеотидной последовательности.  Именно усовершенствования метода Сэнгера, такие как переход на флуорометрическую детекцию и детекцию с помощью капиллярного электрофореза, позволили продвинуть секвенирование ДНК до автоматизированных приборов для секвенирования ДНК.    Второе поколение технологий секвенирования появилось, когда вместо радиомеченых или флуоресцентно меченых нуклеотидов исследователи стали измерять с помощью люминесценции синтез пирофосфата для определения последовательности нуклеотидов. Этот метод, известный как "пиросеквенирование", и приборы, созданные для проведения пиросеквенирования, позволили проводить параллельные реакции секвенирования, что увеличило количество ДНК, которое можно секвенировать за один прогон.     Развивались и другие методы параллельного секвенирования, включая секвенирование с помощью системы лигирования и детекции олигонуклеотидов (SOLiD, Applied Biosystems), которое секвенирует ДНК путем лигирования, и метод секвенирования Ion Torrent, который измеряет разницу в рН, вызванную высвобождением протонов при полимеризации. Наиболее заметным и успешным из этих методов секвенирования второго поколения является метод секвенирования с мостовой амплификацией, который первоначально применялся компанией Solexa, а затем был приобретен компанией Illumina. В этом методе фрагментированная ДНК, меченная адаптером, проходит над участком комплиментарных олигонуклеотидов, закрепленных на проточной кювете. После связывания твердофазная полимеразная цепная реакция (ПЦР) создает кластеры клональных популяций из каждой отдельной исходной нити ДНК, связанной с проточной кюветой. Первый из этих приборов Illumina Genomic Analyzer был способен производить только очень короткие чтения, но он генерировал парные данные с последовательностью на каждом конце. Эти парные данные предоставляют больший объем информации, что обеспечивает большую точность при меньших фоновых помехах по сравнению с другими методами второго поколения.    До сих пор нет единого мнения о том, что определяет разницу между технологиями секвенирования второго и третьего поколения, но для целей данного обзора мы определяем секвенирование третьего поколения как возможность проведения секвенирования одной молекулы. Технологии одномолекулярного секвенирования не требуют этапов амплификации ДНК, что позволяет повысить пропускную способность, ускорить время выполнения теста и увеличить длину чтения.     Несколько компаний стали лидерами в разработке технологий секвенирования третьего поколения, и две наиболее заметные из них - Pacific Biosciences (PacBio, США) и Oxford Nanopore Technologies (Великобритания). Метод PacBio измеряет включение ДНК-полимеразой флуоресцентно меченых нуклеотидов в шаблон комплементарной последовательности. В центре этой технологии находится плотный массив наноструктур с нулевой длиной волны (ZMW - zero-mode wavelength). Эти ZMW-наноструктуры позволяют измерять отдельные флуоресцентно меченные нуклеотиды в режиме реального времени и за короткий промежуток времени. Эта технология способна производить очень длинные чтения длиной до 10 килобаз (кб). Метод Oxford Nanopore Technologies использует нанопоры, как биологические, так и твердотельные, встроенные в мембрану с ионным током. Одноцепочечная геномная ДНК или РНК может проходить через нанопоры, и каждое отдельное нуклеотидное основание физически блокирует ток, который может быть измерен с помощью стандартных электрофизиологических методов.    Что касается современной клинической микробиологической диагностики, то для идентификации бактериальных и грибковых видов по прямому росту колоний часто используется технология секвенирования по Сэнгеру первого поколения. Для идентификации бактерий используются гены 16S рибосомальной РНК (рРНК) и β-субъединицы ДНК-зависимой РНК-полимеразы (rpoB), а для грибов - гены рибосомального внутреннего транскрибируемого спейсера (ITS - internal transcribed spacer) и 28S рРНК.    В настоящее время новые поколения секвенирования (второе и третье) изучаются для использования в клинической микробиологии для идентификации интересующих патогенных организмов. Существует два основных способа достижения этой цели: первый - это улучшение идентификации растущих в культуре организмов с помощью секвенирования всего генома (WGS - whole-genome sequencing). Второй - использование метагеномного секвенирования для идентификации потенциальных патогенных организмов непосредственно из источника, чтобы обойти процесс культивирования и/или улучшить результат. В данном обзоре будут рассмотрены оба эти направления. 3. Полногеномное секвенирование микроорганизмов    Секвенирование всего генома (WGS) - это процесс секвенирования и сборки микробного генома интересующего организма. Эти микробные геномы могут принадлежать бактериям, грибам и вирусам.  WGS для бактерий, микобактерий и грибковых организмов требует культивирования и выделения организма перед выделением нуклеиновых кислот и последующим построением последовательности.    Это является ограничением для организмов, которые трудно или невозможно вырастить в культуре. В случае вирусных геномов WGS используется путем секвенирования непосредственно образца в отношении интересующего вирусного генома, что будет рассмотрено далее в разделе о метагеномном секвенировании.    Для WGS используются технологии секвенирования второго поколения (например, Illumina) или третьего поколения (например, PacBio или Nanopore), преимущества и недостатки которых более подробно описаны в других источниках. Существует множество нюансов того, как получить чистую культуру организма от культуральной чашки до конечных результатов секвенирования с помощью технологий обоих поколений, но в целом рабочий процесс одинаков (рис. 1).     Вкратце, сначала организм извлекается из культуральной чашки и из него выделяется ДНК. После извлечения ДНК создается библиотека, в которой ДНК каждого отдельного организма разрезается на фрагменты и снабжается адаптерами, содержащими уникальный штрих-код, что позволяет проводить мультиплексирование сотен образцов. Эти индивидуальные библиотеки объединяются вместе и передаются в выбранную технологию NGS. После завершения секвенирования проводится биоинформатика для демультиплексирования образцов, затем выполняется фильтрация качества и удаление адаптеров.     Затем существует три способа сборки генома для получения идентификации с помощью WGS. Первый известен как референсная сборка, при которой фрагменты ДНК выравниваются по известному референсному геному и получается консенсусный геном, как пазл. Второй - сборка de novo, при которой все фрагменты ДНК собираются в контиги. (Контиг, от англ. contiguous, представляет собой набор перекрывающихся сегментов ДНК, которые в совокупности представляют собой консенсусную область ДНК. В задаче сборки генома контиги представляют собой продолжительные участки ДНК (строки из нуклеотидов), полученные в процессе сборки - прим.пер.). При сборке de novo трудно получить геномы высокого качества, поэтому более популярным третьим конвейером сборки является гибрид сборки de novo и эталонной сборки, когда фрагменты ДНК собираются в контиги, а затем эти контиги сопоставляются с эталонными геномами. Рисунок 1. Обзор рабочих процессов секвенирования. (a) Полногеномное секвенирование - этот рабочий процесс начинается с получения колонии интересующего микроорганизма. Затем ДНК выделяется, фрагментируется и помещается в библиотеку для подготовки к секвенированию по методу Сэнгера или для других методов NGS. Затем библиотека секвенируется и анализируется с помощью биоинформационного конвейера. (b) Таргетное секвенирование - этот рабочий процесс начинается с клинического образца и включает в себя процесс отбора или обогащения перед подготовкой библиотеки в случае бактерий и грибов. Если интересующим патогеном является вирус, отбор или обогащение происходит после подготовки библиотеки. Затем подготовленные образцы секвенируются и анализируются с помощью биоинформационного конвейера. (c) Секвенирование по методу "дробовика" - этот процесс похож на процесс WGS, но вместо колонии интересующего микроорганизма ДНК или РНК выделяется непосредственно из представленного клинического образца. Выделенная ДНК или РНК проходит через подготовку библиотеки и затем секвенируется. Полученные результаты анализируются с помощью биоинформатики.    WGS микроорганизмов, которые можно культивировать и выделять, может быть использована для идентификации организма, типирования организма в эпидемиологических целях и выявления возможной резистентности организма к антимикробным препаратам. Традиционные методы клинической микробиологии для начальных этапов идентификации культивируемых бактерий включают основные морфологические наблюдения, биохимические тесты и идентификацию с помощью матрично-ассистированной лазерной десорбции-ионизации времяпролетной масс-спектрометрии (MALDI-TOF MS); последний метод по-прежнему очень точен и быстр по сравнению с WGS.     Однако бывают случаи, когда MALDI-TOF MS не позволяет уверенно определить видовую принадлежность, особенно в случае с прихотливыми организмами и анаэробными бактериями. В большинстве случаев достаточно идентификации до уровня рода, но есть случаи, когда видовая идентификация является обязательной из-за различий в профиле чувствительности к антибиотикам между видами.     Например, Enterococcus faecium и Enterococcus faecalis имеют два разных профиля чувствительности к антибиотикам, что имеет клиническое и эпидемиологическое значение. E. faecium обладает резистентностью к ампициллину, и этот вид энтерококков имеет высокий уровень резистентности к ванкомицину, в то время как у E. faecalis и то, и другое встречается относительно редко. С помощью MALDI-TOF MS удается очень точно идентифицировать эти два вида Enterococcus, но это всего лишь крайний пример, показывающий, что идентификация до рода не всегда является достаточной.    Современные методы микробиологической идентификации не позволяют определить серотип бактерии, что очень важно в случаях инфицирования сальмонеллами, когда для лечения очень важно выявить серотип возбудителя. В настоящее время в США идентификация серотипа сальмонелл с помощью WGS проводится в лабораториях общественного здравоохранения. До появления WGS лаборатории использовали импульсный полевой гель-электрофорез (PFGE - pulse-field gel electrophoresis) для идентификации серотипов Salmonella, но сравнительные исследования WGS показали, что он сопоставим с PFGE и WGS стал золотым стандартом.     Существует множество различных биоинформационных подходов, которые используются вместе с WGS для типирования конкретного изолята, и один из основных подходов известен как мультилокусное типирование последовательностей (MLST- multi-locus sequence typing). Этот подход использует набор "домашних" генов (5-7 генов в зависимости от бактерии) для конкретного вида бактерий и использует мутации в этих генах для сравнения степени родства одного бактериального изолята с другим.     MLST с выделением типов последовательностей (ST - sequence type) долгое время был золотым стандартом для типирования организмов с помощью WGS-анализа. Однако в 2014 году Leekitcharoenphon et al. использовали несколько типов биоинформационных анализов, чтобы сравнить различные методы типирования WGS с PFGE для кластеризации вспышек. Они сравнили 18 изолятов Salmonella enterica серовара Typhimurium из шести различных вспышек с помощью PFGE и четырех различных биоинформационных подхода к типированию и обнаружили, что анализ однонуклеотидных полиморфизмов (SNP - single nucleotide polymorphism) был методикой, способным кластеризовать 18 изолятов в соответствующие кластеры вспышек со 100% совпадением.  Хотя этот метод не является золотым стандартом, все больше лабораторий отдают предпочтение SNP-анализу для эпидемиологического отслеживания потенциальных вспышек, поскольку при таком анализе учитывается весь геном, а не только несколько отдельных генов.    В США результаты WGS, полученные лабораториями общественного здравоохранения, курируются и поддерживаются PulseNet, которая представляет собой сеть лабораторий общественного здравоохранения и агентств по контролю качества пищевых продуктов, координируемую Центрами по контролю заболеваний (CDC). Основная задача этой сети - помочь выявить и расследовать потенциальные вспышки в системах производства и распространения пищевых продуктов, что является основной инициативой подхода CDC, известного как One Health. Помимо вышеупомянутой идентификации серотипов Salmonella, PulseNet также проводит WGS для подтипирования и идентификации следующих микроорганизмов: Escherichia coli (O157 и другие E. coli, продуцирующие токсин Шига), Campylobacter, Listeria monocytogenes, Shigella, Vibrio cholerae, Vibrio parahaemolyticus и Cronobacter.    Идентификация серотипов при вспышках заболеваний пищевого происхождения - не единственная область применения WGS в здравоохранении. WGS также используется для эпиднадзора за заболеваниями, предотвращаемыми с помощью вакцин, такими как серогруппы Neisseria meningitidis, серотипы Streptococcus pneumoniae и патогены, резистентные к антимикробным препаратам, такие как Mycobacterium tuberculosis с множественной лекарственной устойчивостью. Одним из заболеваний, предупреждаемых вакцинацией, требующим постоянного мониторинга, является N. meningitidis, поскольку ежегодно происходят многочисленные вспышки. Возможность определить серогруппу и провести WGS изолятов N. meningitidis является ключевым фактором для оказания помощи в сфере общественного здравоохранения, чтобы определить, начинается ли вспышка и необходимы ли меры общественного здравоохранения, такие как массовая вакцинация.    В фундаментальных исследованиях WGS использовали для характеристики изолятов стрептококка группы В (GBS) серотипа IV, выделенных при инвазивных заболеваниях новорожденных, возникших в США и Канаде. Изоляты GBS серотипа IV имеют разнообразный генетический фон, включающий несколько различных ST и клональных комплексов (КК). Интерес представляет высоко распространенная линия ST-452, отнесенная к клональному комплексу CC23, описанному в нескольких странах. WGS и филогенетический анализ основного генома позволили предположить, что ST-452 могла возникнуть в результате генетической рекомбинации с исходным событием и штаммом-основателем, возникшим в результате переноса одного гена между CC23 и гипервирулентной линией CC17. Хромосомное картирование основных факторов вирулентности GBS показало, что штаммы ST-452 имеют уникальный профиль среди штаммов CC23 и CC17. Конъюгация и гомологичная рекомбинация с обменом крупными хромосомными фрагментами, охватывающими сотни килобаз, считаются одним из основных событий, контролирующих непрерывную эволюцию GBS. Резистентность к антимикробным препаратам у GBS также изучалась методом WGS с исследованием большого количества изолятов GBS, колонизирующих беременных женщин.    Большинство изолятов GBS серотипа IV в этом исследовании были ST-459, резистентными к тетрациклину, эритромицину и клиндамицину, впервые обнаруженными в Миннесоте, США, которые считаются основным фактором распространения GBS серотипа IV в Северной Америке. WGS-исследования рекомбинационных событий выявили многочисленные эпизоды капсульного перехода среди этих изолятов. Поразительное генетическое разнообразие и продолжающаяся эволюция GBS убедительно подтверждают необходимость текущего и будущего геномного мониторинга среди всех 10 серотипов GBS, поскольку полученная информация может оказать большое влияние на разработку вакцин против GBS.  В клинической лаборатории WGS доказал свою ценность в программах профилактики госпитальных инфекций, поскольку позволяет выявлять и отслеживать вспышки в пределах стационара.    В значительной части опубликованных работ WGS использовалась для отслеживания вспышек наиболее распространенных нозокомиальных патогенов - метициллин-резистентного золотистого стафилококка и Clostridiodes difficile. WGS помогла отследить вспышки таких тяжелых организмов с множественной лекарственной резистентностью, как резистентная к карбапенемам Klebsiella pneumoniae, резистентный к ванкомицину Enterococcus faecium и резистентная к множеству лекарственных препаратов Acinetobacter baumannii.    В больничных условиях бывают случаи, когда вспышки вызываются более прихотливыми организмами, и WGS используется для идентификации и эпидемиологического отслеживания этих прихотливых организмов, таких как Mycobacterium chimaera. Еще в середине 2010-х годов наблюдался рост заболеваемости инвазивными инфекциями M. chimaera у лиц, ранее перенесших операцию на открытой грудной клетке. Эти изоляты M. chimaera были секвенированы и оказались генетически и эпидемиологически связаны с контаминацией водонагревателей-охладителей, использовавшихся при кардиохирургических операциях у этих пациентов. Эти инфекции не были единичными случаями, поскольку такие водонагреватели-охладители были распространены по всему миру. В этих опубликованных случаях WGS проводился в ответ на подозрение о вспышке инфекции, но можно представить, что по мере повышения эффективности и рентабельности технологии госпитальные инфекционные программы смогут использовать эти технологии в своих диагностических микробиологических лабораториях для мониторинга и предотвращения будущих вспышек. Как видно из нескольких примеров, приведенных выше, WGS может не только обеспечить идентификацию и эпидемиологическое отслеживание организмов, но и дать полный профиль присутствующих генов резистентности к противомикробным препаратам.     Современные методы выявления антимикробной резистентности - это либо фенотипические методы, зависящие от культуры, либо быстрые молекулярные методы, не зависящие от культуры. Культурно-зависимые фенотипические методы зависят от роста организма для интерпретации потенциальной резистентности, а культурно-независимые методы могут выявить только несколько основных маркеров генов резистентности.     Возможность получить полный генотипический профиль антимикробной резистентности организма позволяет получить более полный отчет о потенциальных механизмах антимикробной резистентности, присутствующих в организме. Существует множество опубликованных отчетов, которые показывают перспективность использования WGS для прогнозирования антимикробной резистентности для обычных микроорганизмов, таких как E. coli, S. aureus, Enterococcus faecium, Pseudomonas aeruginosa и Neisseria gonorrhoeae. Основной темой всех этих сообщений была способность генотипического прогнозирования резистентности с помощью WGS соответствовать фенотипической резистентности, зависящей от культуры, что является обязательным условием даже для рассмотрения возможности использования WGS вместо существующих методов. Однако современное состояние технологии WGS не позволяет полностью заменить существующие методы, а скорее дополнить их.    В настоящее время WGS занимает больше времени по сравнению с традиционными культурально-зависимыми и культурально-независимыми методами для обычных организмов, упомянутых выше. В случае, когда WGS может сразу же оказать влияние на прогнозирование резистентности к противомикробным препаратам, речь идет об организмах, которые долго выращиваются или для которых тестирование на чувствительность к противомикробным препаратам является трудоемким, как, например, для N. gonorrhoeae, о которых говорилось ранее, а также для видов Mycoplasma и Ureaplasma.     Еще одна группа труднорастущих организмов, где WGS может помочь ускорить выявление резистентности к противомикробным препаратам, - это медленно растущие микобактерии, такие как Mycobacterium tuberculosis с множественной лекарственной резистентностью. В одном крупном исследовании, известном как Comprehensive Resistance Prediction for Tuberculosis: An International Consortium (CRyPTIC), было проанализировано более 10 000 изолятов M. tuberculosis, и было установлено, что генотипический прогноз для препаратов первого ряда против туберкулеза коррелирует с фенотипической чувствительностью >90%.     Недавнее исследование подтвердило, что WGS может значительно сократить время выполнения традиционного анализа на чувствительность к противомикробным препаратам, который может занимать до месяца. Еще один профиль резистентности микобактерий к противомикробным препаратам, где WGS может быть полезен, - это Mycobacteroides abscessus (ранее Mycobacterium abscessus), которая может обладать индуцируемой резистентностью к кларитромицину, а золотым стандартом для выявления этой резистентности является инкубация бульонных микроразведений в течение 14 дней. Одна из групп подтвердила и внедрила WGS-тест, позволяющий предсказать эту индуцированную устойчивость к кларитромицину, а также резистентность к амикацину всего за 3-5 дней по сравнению со стандартом в 14 дней. Такие случаи уменьшения времени выполнения теста облегчат врачам лечение таких сложных случаев.    Одним из недостатков выявления резистентности к противомикробным препаратам с помощью WGS является то, что выявляются только известные гены резистентности и мутации. Однако продолжение секвенирования организмов с множественной лекарственной резистентностью может привести к открытию новых генов резистентности и механизмов резистентности. Более того, многие группы работают над созданием программ машинного обучения для поиска резистентности к противомикробным препаратам.    Использование WGS для идентификации грибов в клинической диагностике менее обосновано, чем для идентификации бактерий, но можно увидеть, где это может быть более выгодно по сравнению с существующими морфологическими методами идентификации в микологии, которые могут быть субъективными. В одном из исследований было показано, что корреляция между фенотипической идентификацией, использующей микроскопическую и колониальную морфологию и физиологические исследования, и секвенированием области D2 большой субъединицы гена рРНК и полных областей ITS многих распространенных и редких клинически значимых плесеней составляет приблизительно 50%.     WGS использовался в нескольких расследованиях вспышек контаминации лекарственных препаратов, например в Чили и Колумбии, где препарат против тошноты был контаминирован Sarocladium kiliense, который вызвал инфекции кровотока у людей. Другим примером вспышек грибковых заболеваний, вызванных контаминацией медикаментов, является Exserohilum rostratum. Более 13 000 пациентов получили различные виды инъекций (эпидуральные, параспинальные и суставные) контаминированным ацетатом метилпреднизолона (MPA). WGS удалось связать эти случаи и отследить контаминацию до трех партий контаминированного MPA.    Одним из наиболее заметных примеров использования WGS для идентификации грибов и эпидемиологического отслеживания является появление грибков с множественной лекарственной резистентностью - Candida auris. Сообщалось, что C. auris вызывает смертельные инфекции и вспышки в больницах и учреждениях длительного ухода по всему миру. Известно, что C. auris трудно идентифицировать стандартными лабораторными методами из-за его сходства по внешнему виду и биохимическим характеристикам с другими кандидами. Обычные биохимические тесты обычно ошибочно идентифицируют C. auris как Candida haemulonii, а также с другими грибками, такими как Candida parapsilosus и Rhodatorula spp.. Существует обогащенный бульон, который можно использовать для преодоления ошибочной идентификации C. auris; однако для этого требуется 21 день инкубации с последующим получением агаровой культуры. Результаты WGS  были использованы для подтверждения идентичности возбудителя и эпидемиологического мониторинга по всему миру.    Прогнозирование резистентности к противогрибковым препаратам с помощью WGS изучается у грибков, таких как Candida, но до недавнего времени не было опубликовано исследований по прогнозированию резистентности к противогрибковым препаратам грибков с помощью WGS. Тем не менее, многочисленные изоляты аскомицетного грибка Aspergillus fumigatus были исследованы с помощью WGS для изучения доминирующего механизма резистентности при мутациях гена, кодирующего белок, на который направлено действие триазольных противогрибковых препаратов.     WGS было проведено для 24 изолятов, как резистентных к азолам, так и чувствительных к ним, полученных из клинических и экологических источников из нескольких стран. Биоинформационный анализ SNPs высокого разрешения подтвердил мутацию TR34/L98H как единственный механизм резистентности к азолам. Используя этот подход, расширенные исследования 218 изолятов A. fumigatus, как клинических, так и из окружающей среды, из Великобритании и Ирландии, были изучены методом WGS для определения молекулярной эпидемиологии грибка и выяснения, происходит ли приобретение лекарственно-устойчивых изолятов группами риска.     Анализ данных подтвердил, что изоляты, резистентные к азолам, передаются из окружающей среды. Эти данные были использованы для проведения геномных исследований ассоциаций (GWAS - genome-wide association studies) и пангеномного анализа с целью выявления вариаций, связанных с резистентностью к итраконазолу, что позволило обнаружить потенциально новые механизмы резистентности, имеющие полигенную основу. Приведенные выше примеры иллюстрируют возможности WGS в изучении Aspergillus и резистентности к противогрибковым препаратам, однако существует множество примеров скоплений клинически значимых грибов в условиях клиники, где эта технология потенциально может раскрыть важные эпидемиологические проблемы инфицирования и распространения, а также резистентности к противогрибковым препаратам. Необходимо провести работу по изучению и внедрению в лабораториях соответствующих методов идентификации грибов с помощью WGS.  Полезной будет не только идентификация и эпидемиологическая информация, но и прогнозирование резистентности к противогрибковым препаратам с помощью WGS - это логичный следующий шаг, который может реально улучшить лечение грибковых инфекций.    Когда речь заходит о внедрении NGS-технологий в лаборатории клинической микробиологии, непосредственным применением NGS-технологии является WGS. WGS колоний непосредственно из культуры позволяет получить обширные знания, сопоставимые с обычным микробиологическим рабочим процессом. Однако WGS обеспечивает не только стандартную идентификацию и прогнозирование резистентности к противомикробным препаратам, но и возможность сравнения изолятов между собой для выявления вспышек заболеваний. Мы считаем, что внедрение WGS - это возможный первый шаг к внедрению NGS в лабораторию, поскольку он дополняет, а в некоторых случаях и улучшает обычный рабочий процесс микробиологической лаборатории. 4. Метагеномное секвенирование непосредственно образца    Если говорить о будущем NGS в клинической микробиологии, то главным преимуществом секвенирования метагеномов непосредственно из клинического образца является полное исключение процесса культивирования. Это может значительно сократить время выполнения исследований и предоставить медицинским работникам более своевременные ответы.     Существует два различных NGS-подхода к секвенированию метагеномов, которые могут быть использованы для обнаружения патогенов непосредственно из клинического образца (рис. 1). Первый - это процесс обогащения, известный как глубокое ампликонное или целевое секвенирование, при котором к выделенной ДНК применяются специфические праймеры для амплификации нужной группы патогенов (например, бактерий или грибов) или одного конкретного патогена, представляющего интерес (например, ВИЧ, SARS-CoV-2).     Второй подход известен как секвенирование методом дробовика (shotgun metagenomics), когда секвенируется вся выделенная ДНК или РНК из клинического образца, а работа по определению потенциального патогена выполняется в биоинформационном конвейере. Такой подход позволяет расширить сеть для поиска потенциальных патогенов, представляющих интерес.     В настоящее время еще нет одобренных Управлением по контролю качества пищевых продуктов и лекарственных средств США (FDA) NGS-тестов для любого из этих подходов. Подобно WGS-тестам в лабораториях общественного здравоохранения, существуют лаборатории, сертифицированные в соответствии с Поправками к закону о совершенствовании клинических лабораторий (CLIA), в которых разработаны лабораторные тесты для прямого метагеномного секвенирования образцов. Существует несколько коммерческих вариантов метода дробовика, которые будут рассмотрены ниже.    4.1. Целевое (таргетное) секвенирование    Целевое секвенирование - это метод секвенирования, при котором процесс отбора или обогащения проводится для интересующего организма или группы организмов либо до, либо после процесса подготовки библиотеки (рис. 1). Существует несколько методов, которые могут быть использованы для выделения конкретного организма или группы организмов, представляющих интерес, и они включают в себя: ПЦР-амплификация и гибридизация зондов. Преимущество всех этих методов заключается в меньшем вмешательстве человеческой ДНК и более высокой чувствительности обнаружения в образцах с большим количеством человеческих клеток (например, в тканях или мокроте). Основным недостатком этих методов направленного секвенирования является ограниченное число патогенов, которые можно обнаружить. Целевое секвенирование непосредственно из образцов проводилось с использованием технологических платформ второго и третьего поколения.    ПЦР-амплификацию при целевом секвенировании также называют глубоким ампликонным секвенированием. Глубокое ампликонное секвенирование - это расширение технологии ПЦР, обеспечивающее более глубокий охват интересующего гена (генов). Наиболее известными применениями глубокого ампликонного секвенирования являются амплификация гена 16S рибосомальной РНК (16S рРНК) для идентификации бактерий и 28S рРНК или рибосомальных генов ITS для идентификации грибов.    Многие лаборатории утвердили и внедрили тесты для глубокого ампликонного секвенирования с идентификацией как бактерий, так и грибов, а одна группа даже продемонстрировала полезную схему, включающую оба метода. Кроме того, глубокое ампликонное секвенирование 16S облегчило идентификацию более трудно выращиваемых организмов, включая клещевые бактерии, которые обычно не обнаруживаются в обычных бактериальных культурах (например, Borrelia, Anaplasmsa, Ehrlichia и Rickettsia).     В частности, амплификация гена 16S была продемонстрирована в клинических условиях для различных типов образцов, включая суставную жидкость, кровь и спинномозговую жидкость (ЦСЖ). В случае перипротезных инфекций суставов (ППИС) обычная чувствительность бактериальной культуры, как известно, несовершенна из-за того, что пациенты получали предыдущие курсы антимикробной терапии. Было проведено сравнительное исследование пациентов с подозрением на ППИС для сравнения чувствительности целевого 16S-секвенирования с обычным бактериальным посевом, чтобы определить, улучшилась ли идентификация микроорганизма, вызвавшего инфекцию.     В общей сложности 47 ППИС локтевого сустава были положительными при секвенировании, и четыре из них (8%) были отрицательными при культивировании и положительными при целевом 16S-секвенировании. Всего было восемь случаев расхождения результатов между традиционной бактериальной культурой и целевым 16S-секвенированием, и они были получены в образцах ППИС, которые представляли собой полимикробные инфекции. В четырех случаях целевое 16S-секвенирование выявило дополнительные патогены. Эти данные отражают ценность и сложность целевого 16S-секвенирования, способного предоставить дополнительную информацию о таких ППИС, особенно в случаях, когда они являются культурально-негативными. Это исследование было проведено ретроспективно, но можно представить, что дополнительная информация, полученная в результате целевого 16S-секвенирования, могла бы изменить результаты терапии и состояние пациента.    Прямое глубокое ампликонное секвенирование образцов для идентификации грибов было изучено в ограниченной степени на свежих образцах и показало определенный успех. Однако единственный тип образцов, где глубокая ампликонная амплификация грибов показала свою перспективность и большую клиническую пользу, - это ткани с парафиновыми вкраплениями, фиксированные в формалине (FFPE).     Одним из традиционных методов выявления инвазивных грибковых инфекций является микроскопическая визуализация грибковых элементов в тканях FFPE в сочетании с положительным результатом культивирования. Однако нередки случаи, когда грибковые элементы обнаруживаются в тканях FFPE, но результат культивирования отрицательный или культура не была поставлена, поскольку это могла быть случайная находка. Кроме того, грибковые элементы, обнаруженные в тканях FFPE, могут быть неправильно идентифицированы в 21% случаев. Глубокое ампликонное секвенирование грибков в тканях FFPE может предложить врачам точную идентификацию увиденных организмов и позволить им применить правильный вариант противогрибковой терапии. В частности, было показано, что глубокое ампликонное секвенирование ITS позволяет идентифицировать грибковые элементы, обнаруженные в тканях FFPE, даже если на слайде присутствовало менее 50 грибковых организмов.   Метод глубокого ампликонного секвенирования используется в клинической вирусологической диагностике, в частности для определения резистентности к противовирусным препаратам у цитомегаловируса (ЦМВ) и вируса иммунодефицита человека (ВИЧ). Оба вируса имеют хорошо известные мутации в своих геномах, которые придают устойчивость к специфическим для каждого вируса противовирусным препаратам и подробно рассмотрены в других источниках. Коммерческое выявление известных маркеров резистентности к противовирусным препаратам с помощью секвенирования для ЦМВ - это тест, выполняемый как компанией Viracor, так и ARUP Laboratories. Лишь компания Viracor предлагает тест для определения профиля устойчивости к противовирусным препаратам с помощью секвенирования для ВИЧ-1 в дополнение к генотипированию интегразы ВИЧ-1.    Популярным подходом к целевому секвенированию, который используется при секвенировании генома человека, является обогащение зондов. В этом методе используются небольшие гибридизационные зонды, которые собираются в панели, включающие от 50 до миллионов зондов. В контексте секвенирования генома человека и панелей мутаций эти гибридизационные зонды добавляются к фрагментированной ДНК и обогащаются для выявления интересующих генов или мутаций.     Эта технология была усовершенствована для применения в клинической лаборатории с созданием панели гибридизации бактериальных зондов, известной как система секвенирования с захватом бактерий (BacCapSeq), и панели гибридизации вирусных зондов, известной как платформа секвенирования с захватом вирусов позвоночных (Virome Capture Sequencing Platform for Vertebrate Viruses (VirCapSeq-VERT). В настоящее время нет опубликованных работ, свидетельствующих о том, что эти специфические панели гибридизации зондов используются в клинической микробиологической диагностике.    Метод гибридизации зондов использовался в здравоохранении для обнаружения и отслеживания важных глобальных вирусных патогенов. В частности, в случае с вирусом Зика этот метод помог выявить линию и провести эпидемиологическое отслеживание вируса во время вспышки в середине 2010 года. Успех с вирусом Зика помог перенести этот подход на текущую пандемию SARS-CoV-2. Многие лаборатории общественного здравоохранения внедрили метод обогащения зондов для секвенирования SARS-CoV-2 непосредственно из представленных образцов, чтобы определить вариант, циркулирующий в обществе. Пока нет единого мнения о том, существует ли клиническая необходимость в генотипировании SARS-CoV-2 на уровне вариантов, но метод обогащения зондов делает это более достижимой возможностью, если лаборатория располагает соответствующими возможностями.    4.2. Секвенирование метагеномов методом дробовика     В отличие от целевого секвенирования, секвенирование метагеномов методом дробовика позволяет охватить более широкую сеть, поскольку секвенируются все нуклеиновые кислоты в образце (рис. 1).  Секвенирование всех нуклеиновых кислот позволяет выявить почти все патогены, включая бактерии, грибы, вирусы и паразитов, с помощью одного теста.     Этот метод секвенирования был успешно применен для выявления инфекции в различных образцах, включая обычно стерильные источники, такие как ЦСЖ, кровь и суставная жидкость. Кроме того, было продемонстрировано, что он помогает обнаружить инфекционный агент в образцах, в которых присутствует собственный микробиом, например, в образцах дыхательных путей, желудочно-кишечного тракта и мочи. Одним из ограничений метагеномного секвенирования методом дробовика является фон или интерференция нуклеиновых кислот человека или микробиома резидента, что может быть особенно опасно в таких образцах, как ткани или дыхательные секреты.    Этот подход был реализован в нескольких лабораториях в виде валидированного теста, и эти лаборатории служат клиническими референс-центрами для пациентов. Первая из них находится в сертифицированной по CLIA лаборатории клинической микробиологии Калифорнийского университета в Сан-Франциско и предлагает тест на метагеномное секвенирование ЦСЖ методом дробовика. Общая точность этого теста составляет 90%, а клиническая чувствительность и специфичность - 73% и 99% соответственно.    Имеются сообщения о различных случаях, свидетельствующих о диагностической пользе этого теста в случаях, когда все другие традиционные диагностические тесты были отрицательными, включая случай нейроцистицеркоза, вызванного инфицированием Taenia solium, случай вируса Западного Нила и случай нейробруцеллеза. С помощью этого теста было проведено годичное проспективное многоцентровое клиническое исследование пациентов с клинической картиной энцефалита, менингита и миелита, целью которого было определить полезность теста для диагностики этих заболеваний. С помощью метода дробовика в ЦСЖ было выявлено больше патогенов, чем при традиционном прямом выявлении в ЦСЖ (культура, анализ на антигены или экспрессные молекулярные методы).    Однако авторы не утверждают, что этот тест может заменить традиционные методы диагностики, но улучшить диагностический подход. Этот же метод метагеномного секвенирования был применен к другим жидкостям организма, включая абсцессы, суставную жидкость, перитонеальную жидкость, плевральную жидкость, бронхоальвеолярный лаваж (БАЛ) и мочу. Следует отметить, что в клинических лабораториях данного референс-центра нет возможности использовать данный метод секвенирования метагеномов методом дробовика для других биологических жидкостей. Единственный предлагаемый дробовой метагеномный тест - это исследование ЦСЖ.    Существует несколько коммерческих компаний, которые взяли за основу методологию дробовика и создали коммерческие анализы для различных источников организма. Первый из них, о котором мы расскажем, - это тест Karius для крови/плазмы. Этот тест, называемый тестом на свободную от клеток ДНК микроорганизмов или неинвазивной жидкой биопсией, был впервые представлен на рынке диагностики инфекционных заболеваний в 2016 году. Он предназначен для неинвазивного выявления глубоко залегающих инфекций и инфекций кровотока. В одном образце крови можно обнаружить >1250 мишеней различных бактериальных, грибковых, ДНК-вирусов и эукариотических паразитов.    В отчете для пациентов количество обнаруженных целей выражается в молекулах ДНК на микролитр (MPM). Результаты по обнаруженным мишеням представлены в графическом виде, что позволяет сравнить количество случаев обнаружения данной мишени программой Karius. В различных исследованиях было обнаружено и зарегистрировано более одной цели. Частота обнаружения нескольких патогенов различна, что подтверждается опытом авторов. Все мишени, обнаруженные в образце крови, представлены в иерархическом порядке, причем мишень с наибольшим содержанием, MPM, указана первой. Необходимо оценить результаты и использовать клиническое суждение, чтобы определить клиническую значимость некоторых обнаруженных мишеней. Показатели позитивности (%) для обнаруженных патогенов в представленных образцах варьируются в зависимости от возраста пациентов и от учреждения, но в среднем могут составлять 50-70%. При повышении дискриминации при заказе теста показатели позитивности могут быть более высокими.    Среди исследований, оценивающих совпадение положительных результатов секвенирования по Karius с обычными культурами, есть исследование, в котором изучались 2000 образцов, протестированных Karius, и было отмечено 97% совпадение положительных результатов секвенирования с результатами посева крови у пациентов с сепсисом. Существует еще несколько различных исследований, одни проспективные, другие ретроспективные, с относительно небольшим количеством пациентов, в которых совпадение результатов тестирования Karius и культуры или рибосомного секвенирования варьировало от 58 до 100%.     Приведенные ниже два случая демонстрируют широту применения теста для некультивируемых и культивируемых микроорганизмов и показывают полезность теста Karius при клинических инфекционных заболеваниях. Некоторые конкретные данные и описание были изменены для обеспечения анонимности пациентов. Описание случая №1.    У маленького ребенка с синдромом Ди Джорджа через 2 недели после хирургического лечения порока сердца, все еще находившегося на аппарате ИВЛ, развились лихорадка и двусторонние легочные помутнения. Посевы крови и мокроты не выявили бактерий и грибов. Образец крови был отправлен на анализ по Karius, и через 48 часов был получен результат: 1365  MPM ДНК Pneumocystis jirovecii.     Пациенту была начата специфическая терапия против Pneumocystis jirovecii, состояние улучшилось, и он был отключен от аппарата ИВЛ. Через несколько дней анализ ПЦР на P. jirovecii в эндотрахеальном образце также оказался положительным. Последующий тест Karius через 2 недели был положительным на P. jirovecii в 65 MPM ДНК. Описание случая №2.    Ребенок поступил с недельной повышенной температурой >38 С. При осмотре был обнаружен ранее не выявленный шум в сердце - аортальная регургитация, а эхокардиограмма показала двустворчатый аортальный клапан с большими вегетациями и разрывом клапана. Первоначально рутинные культуры крови были отрицательными. Через 36 часов тест Karius в плазме крови показал наличие Kingella kingae с 1890 МРМ ДНК. Были начаты антибиотики, и пациенту была проведена экстренная замена аортального клапана. Повторный тест Karius через 16 дней дал положительный результат на Kingella kingae с 55 MPM ДНК. Аэробные культуры крови оказались положительными через 9 дней инкубации, и тот же микроорганизм был выделен и идентифицирован с помощью масс-спектрометрии MALDI-TOF и секвенирования 16S рРНК.    Более поздние публикации о тесте Karius включают ретроспективный обзор использования теста в крупной детской больнице в Техасе, США. Авторы пришли к выводу, что в целом обычное микробиологическое исследование дает те же результаты, что и тест Karius, но с более коротким временем выполнения. Кроме того, у большинства пациентов при выявлении дополнительных микробных агентов с помощью теста Karius терапевтическое лечение не менялось. Напротив, проспективное исследование этого теста в сравнении с посевом крови и другими стандартными микробиологическими исследованиями у взрослых пациентов с лейкемией и фебрильной нейтропенией показало, что результаты теста Karius могли бы позволить более раннюю оптимизацию антимикробных препаратов у 47% пациентов.    Это было сравнительно небольшое исследование, включавшее 55 пациентов, но при оценке клинических данных было установлено, что причиной лихорадки у 87% пациентов была инфекция. По мнению многих экспертов в области инфекционных заболеваний, ценность теста Karius заключается в обнаружении неожиданных, трудно выявляемых или трудно культивируемых патогенов. Примером может служить обнаружение Rhizopus у одного пациента в вышеупомянутом исследовании в двух разных временных точках, когда на культивирование и идентификацию грибов уходило несколько дней.    Хотя повторное тестирование по Karius может быть проведено у пациента, оно обычно не повторяется, и нет контролируемых исследований, демонстрирующих преимущества серийного тестирования. В некоторых ситуациях, например при наличии трудно поддающегося лечению микроорганизма, вызывающего эндокардит или другие необычные инфекции, можно привести аргументы в пользу повторения теста, чтобы увидеть значительное снижение MPM после двух- или нескольких недель антимикробной терапии. Поскольку тест Karius очень дорог (2000 долларов за тест с дополнительными расходами, иногда значительными, в зависимости от учреждения), в некоторых медицинских центрах существуют процессы управления (например, консультации/проверка местными руководителями лабораторий в области диагностической микробиологии и инфекционных заболеваний взрослых и детей) для оценки необходимости проведения теста или любых последующих тестов Karius. Остается много нерешенных вопросов, касающихся использования и времени выполнения этого теста, значимости полимикробных результатов и того, насколько клинические результаты компенсируют высокую стоимость теста.    Еще одним коммерчески разработанным метагеномным тестом по методу дробовика является Explify™ Respiratory, который выполняется преимущественно на БАЛах и был выпущен компаниями IDbyDNA и ARUP Laboratories в 2017 году. Выделение РНК и ДНК из образцов БАЛ сопровождается подготовкой библиотек комплементарной ДНК и NG-секвенирования ДНК и секвенированием на приборах NextSeq или NovaSeq (Illumina) с медианной глубиной секвенирования 3-5 миллионов чтений. Explify™ Respiratory позволяет обнаружить >900 бактериальных, грибковых и вирусных респираторных патогенов. Обнаружение микроорганизмов основано на порогах обнаружения, установленных в ходе исследований по контролю качества, и результаты представляются полуколичественно. Результаты также стратифицируются и сообщаются как потенциальные патогены или дополнительные микроорганизмы на основе известной патогенности.     Этот клинический метагеномный NGS-анализ был применен для изучения пневмонии у различных групп пациентов, особенно у детей и взрослых с ослабленным иммунитетом. У таких пациентов часто наблюдаются загадочные пневмонические процессы, на которые не всегда дают ответ обычные бактериальные и грибковые культуры, а также однократные или мультиплексные ПЦР-анализы. Примером его полезности является выявление пропущенных патогенов у иммунокомпрометированных детей с пневмонией. Ранее пропущенные предполагаемые микробные патогены были выявлены в 18 из 41 (44%) БАЛ этих детей с угрожающей жизни пневмонией, включая 7 из 11 (64%) детей с фатальными инфекциями. Анализ Explify™ Respiratory выявил один патоген у 12 детей (63%), два - у 5 (26%) и четыре патогена - у 1 (5%) пациента. У этого количества детей были обнаружены бактериальные (13), грибковые (7) и вирусные (3) патогены.    Аналогичным образом, 30 иммунокомпрометированных взрослых с 31 эпизодом пневмонии прошли бронхоскопию и исследовали БАЛ с помощью теста Explify™ Respiratory, а результаты сравнивали с результатами традиционного микробиологического исследования (ТМИ). Окончательный микробиологический диагноз был поставлен в 11 случаях (35%) при использовании только ТМИ и в 18 случаях (58%) при использовании ТМИ и Explify™ Respiratory. Окончательный диагноз был поставлен в 20/31 случае (65%) только с помощью ТМИ и в 23/31 случае (74%) на основании ТМИ плюс Explify™ Respiratory, что не является большой разницей. Однако диагностическое преимущество анализа Explify™ Respiratory в основном заключалось в выявлении дополнительных бактериальных причин, а для диагностики грибковой пневмонии он оказался менее полезным в данном исследовании. Очевидно, что при интерпретации результатов Explify™ Respiratory, а также их значимости в контексте клинического состояния пациента необходимо руководствоваться клиническими суждениями. Иногда результаты анализа Explify™ Respiratory оказываются впечатляющими, но неожиданными; например, Pneumocystis jiroveccii (дрожжеподобный грибок) у пациента с ослабленным иммунитетом.    Примером потенциальной диагностической и клинической ценности теста Explify™ могут служить два взрослых пациента с ослабленным иммунитетом, страдающих пневмонией и отрицательными результатами обычных микробиологических исследований, у которых методом клинической метагеномики в БАЛ были обнаружены только Pantoea agglomerans или Ewingella americana. Рентгенологические данные соответствовали пневмонической патологии. Хотя это относительно редкие организмы, они могли способствовать развитию патологии, описанной у пациентов с ослабленным иммунитетом. Для диагностики загадочных пневмонических процессов, особенно у пациентов с ослабленным иммунитетом, целесообразно сочетать стандартные микробиологические диагностические подходы с данным анализом, чтобы дополнить клинические решения.    Наконец, коммерческая компания IDbyDNA расширила метагеномный подход, используемый в Explify™ Respiratory, на диагностику инфекций мочевыводящих путей с маркерами резистентности к противомикробным препаратам, и несколько соответствующих докладов были представлены на 32-м Европейском конгрессе по клинической микробиологии и инфекционным болезням, Лиссабон, Португалия, 23-26 апреля 2022 года. Эта панель идентификации патогенов в моче/антимикробной резистентности позволяет выявить >190 патогенов, включая 135 бактерий, 35 вирусов, 14 грибков и 7 паразитов, а также >2000 маркеров антимикробной резистентности. Ожидается, что дальнейшие подробности из рецензируемых работ расширят наше представление о применении и ценности этого метагеномного подхода для обнаружения патогенов в моче.    Применение метагеномики методом дробовика прошло долгий путь при различных инфекциях, описанных выше (менингит/энцефалит, сепсис, пневмония и инфекции мочевыводящих путей). Исследования, использующие этот подход для диагностики инфекций костей, связанных с ними тканей, а также собственных или протезированных суставов, ограничены. Данные для оценки относительной клинической ценности, влияния на клинический исход, чувствительности и специфичности недостаточны. 5. Факторы, которые следует учитывать при внедрении этих технологий    Что касается внедрения в лаборатории, то в настоящее время не существует утвержденных FDA США тестов для WGS, но многие лаборатории, сертифицированные CLIA, включая лаборатории общественного здравоохранения, имеют валидированные тесты для проведения WGS, включая и биоинформационные рабочие процессы. При принятии решения о том, является ли внедрение этих технологий секвенирования оптимальным для вашей лаборатории, необходимо учитывать множество факторов. Существует несколько отличных обзоров, в которых это обсуждается более подробно, но мы остановимся на нескольких основных факторах, которые мы считаем наиболее важными перед внедрением технологий секвенирования в клиническую микробиологию.    Первый фактор, который необходимо учитывать, - это процесс валидации лаборатории для этих NGS-приложений (т. е. WGS, целевой метагеномики и метагеномики дробовиком). Процесс валидации лабораторных тестов очень дорог и занимает много времени, что ограничивает круг лабораторий, которые могут использовать этот тип технологии. Параметры, необходимые для валидации лабораторных тестов, могут быть труднодостижимыми для таких приложений NGS.     Основные аспекты контроля качества лабораторных тестов для NGS трудно определить, поскольку в сообществе клинических микробиологов нет согласованного референсного стандарта. В случае с WGS легко определить последовательность штамма положительного типа и отрицательного контроля при каждом анализе, чтобы убедиться, что анализ работает правильно. Однако при использовании метагеномных подходов лабораториям придется собирать макет сообщества или пробы с интересующими организмами, и опять же нет согласия по поводу состава этих макетов сообществ.     Также трудно найти метод золотого стандарта для точного сравнения с результатами применения NGS, поскольку во многих случаях было показано, что применение NGS превосходит стандартные методы в обнаружении микроорганизмов. Недавно CDC США и Ассоциация лабораторий общественного здравоохранения США (APHL) создали веб-справочник, содержащий инструменты и ресурсы для систем управления качеством, к которым лаборатории могут обратиться при рассмотрении вопроса о валидации этих тестов (https://www.cdc.gov/labquality/qms-tools-and-resources.html). Однако даже при наличии этих инструментов и ресурсов сложность этих NGS-подходов и строгий процесс валидации в настоящее время удерживают эту технологию в пространстве референс-лабораторий и крупных академических медицинских центров.    Второй фактор, который необходимо учитывать при внедрении этих NGS-технологий, - это представление результатов, особенно в части интерпретации и клинической полезности метагеномных подходов.  Создание биоинформационных конвейеров для обработки данных о последовательностях требует значительного времени и опыта, причем не только для кодирования и вычислений, но и для микробиологической и клинической интерпретации результатов.     В настоящее время не существует коммерциализированных биоинформационных программ для интерпретации данных, однако несколько крупных академических медицинских центров опубликовали свои рабочие процессы для всех трех приложений NGS - WGS, целевого секвенирования и метагеномики методом дробовика. Один из аспектов, который мы поддерживаем и который несколько лабораторий рекомендовали для помощи в интерпретации и представлении результатов этих NGS-приложений, - это создание и использование группы лиц или консультативного совета. Члены группы/совета могли бы быть экспертами, помогающим в интерпретации интересных или неоднозначных результатов, и гарантировать, что сообщаемые результаты соответствуют клинической картине.    Последний важный фактор, который необходимо учитывать при внедрении этих NGS-подходов в лаборатории клинической микробиологии, - это стоимость. Хотя стоимость секвенирования образца или организма снизилась, затраты на внедрение этой технологии в лаборатории клинической микробиологии очень велики. Одним из первых препятствий, связанных с затратами, является наличие физического пространства для проведения лабораторной части анализа. Важно, чтобы лаборатория была приспособлена для раздельного хранения материалов и помещений до и после амплификации. Это поможет уменьшить возможную контаминацию образцов. Еще одной крупной статьей расходов, о которой уже упоминалось, является валидация тестов. Кроме того, после того как тест будет утвержден и внедрен, его трудно будет включить в лабораторию, чтобы заменить традиционные микробиологические культуры, которые обычно стоят не так дорого. 6. Будущее NGS в клинической микробиологии    Использование NGS в лаборатории клинической микробиологии уже стало реальностью, но только для немногих лабораторий, имеющих бюджет и персонал, позволяющий это сделать. В этом обзоре мы выдвигаем гипотезы и прогнозируем некоторые из потенциальных будущих направлений развития этой технологии в диагностической микробиологии. Во-первых, процесс секвенирования значительно подешевел с момента появления первого поколения секвенаторов. Можно предположить, что эта технология станет дешевле, что позволит ей быть более доступной для лабораторий, не входящих в состав крупных референс-лабораторий или крупных академических медицинских центров. Мы считаем, что секвенирование может стать недорогим и достаточно быстрым по сравнению с культурально-зависимыми методами. Например, с помощью WGS можно будет идентифицировать колонию, растущую на чашке, и получить АST-профиль этого организма за время, сравнимое с тем, которое требуется для проведения и простой идентификации при обычном микробиологическом исследовании.    Если рассматривать АST-тестирование, то основным критерием внедрения молекулярного AMR-тестирования в общее микробиологическое обследование является соответствие между фенотипическими и генотипическими результатами AMR.  Даже если в генотипическом профиле обнаружен маркер гена резистентности к антибиотикам, нет гарантии, что этот ген транслируется и транскрибируется для производства фермента или белка, обеспечивающего резистентность, если это не видно в результатах фенотипической чувствительности.     В будущем было бы полезно включить в программу исследования рабочий протокол протеомики, чтобы увидеть, какие белки экспрессируются, что поможет сделать вывод о фенотипических профилях чувствительности к антибиотикам.    Еще одна область, в которой в ближайшие 5 лет может быть достигнут значительный прогресс, - это биоинформационный анализ, в частности, для секвенирования метагеномов с методом дробовика. Существующие в настоящее время биоинформационные конвейеры для секвенирования методом дробовика позволяют обнаружить множество патогенов, присутствующих в данном образце. Однако современные технологии не позволяют собрать полный геном патогена, если только это не вирус. В будущем можно представить, что биоинформационный конвейер для проведения метагеномики методом дробовика в клиническом образце будет достаточно сложным, чтобы определить истинную сборку полного генома патогена с возможностью прогнозирования маркеров вирулентности и резистентности к противомикробным препаратам. 7. Заключение    Технологии NGS существуют уже несколько десятилетий, но только начинают менять диагностический потенциал лабораторий клинической микробиологии и здравоохранения. В этих областях WGS позволяет идентифицировать организмы и осуществлять надзор за потенциальными вспышками заболеваний. Кроме того, WGS помогает обнаружить не только известные гены и механизмы антимикробной резистентности, но и новые гены или механизмы, которые на данный момент не определены. Целевое и метагеномное секвенирование непосредственно из образцов помогает увеличить количество обнаруженных организмов, представляющих интерес, особенно тех, для которых обычные методы недостаточно чувствительны или недоступны. Эти технологии NGS меняют облик клинической микробиологической диагностики, какой мы ее знаем. Хотя NGS не может заменить обычные лабораторные исследования в области микробиологии, объем информации, получаемой с помощью секвенирования, только улучшит качество лечения пациентов.

Популярные новости

Новая миниатюрная платформа для ПЦР в реальном времени MOLECULAR MOUSE (производитель Alifax, Италия). Подборка аннотаций статей.

Anna Marzucco et al. Оценка эффективности нового диагностического теста для прямого обнаружения РНК SARS-CoV-2 с использованием портативной системы MOLECULAR MOUSE.

Предпосылки 

   Диагностика COVID-19 в значительной степени зависит от молекулярных анализов с коротким сроком выполнения. Большинство диагностических наборов для выявления генома SARS-CoV-2 требует наличия квалифицированного персонала, большого количества приборов и рабочих процессов, которые могут быть выполнены только в высокоспециализированных лабораториях, что подразумевает высокую стоимость и задержки в проведении теста. 

   Мы оценили клиническую эффективность теста MOLECULAR MOUSE (MM) DIRECT COVID-19 с помощью системы MOLECULAR MOUSE, инновационного миниатюрной платформы для ПЦР в реальном времени, для выявления РНК SARS-CoV-2 непосредственно из оро/назофарингеальных мазков примерно за один час. Тест состоит из раствора для лизиса раствора для простой подготовки образца и готового к использованию картриджа Lab-On-Chip содержащий все реагенты для специфического обнаружения вирусного ORF1b и гена нуклеокапсидного и гена нуклеокапсидного белка (N1 и N2). 

   Целью исследования была оценка ММ DIRECT COVID-19 в сравнении с клинико-диагностическими характеристиками AllplexTM SARS-CoV-2 (Seegene), референсным методом RT-PCR, который регулярно используется в нашей лаборатории.

Методы 

   Оценивались 689 свежих и замороженных оро/назофарингеальных мазков (собранных в течение 48 ч от начала симптомов) положительных и отрицательных пациентов с COVID-19. Образцы были собраны в период с 23/08/2021 по 07/10/2021. Анонимизированные образцы, отобранные с различной вирусной нагрузкой, были проанализированы одновременно с помощью MM DIRECT COVID-19 и референсным методом. Остаточные образцы мазков загружались на платформу MOLECULAR MOUSE для валидационного исследования в соответствии с инструкциями производителя. 

Результаты 

   Результаты теста MM DIRECT COVID-19 на 689 образцах (247 положительных и 442 отрицательных на Allplex SARS-CoV-2), показали 94,33% чувствительности (233/247) и 99,32% специфичности (439/442) по сравнению с референсным методом (табл. 1). Все 14 ложноотрицательных результатов были получены при высоком значении Ct (между 30-36), что указывает на низкую чувствительность теста только в образцах с низкой вирусной нагрузкой. 

Выводы 

   Мы продемонстрировали, что тест MM DIRECT COVID-19 является точным для подтверждении диагноза SARS-CoV-2. Даже менее опытные пользователи могут выполнить его
простой рабочий процесс и получить результаты примерно за один час. В заключение следует отметить, что мы провели клиническое обоснование быстрого, специфичного и простого в использовании теста, который может способствовать децентрализации тестирования на SARS-CoV-2 в небольших неспециализированных подразделениях (т.е. в клиниках неотложной помощи), в том числе в развивающихся странах.


Источник: Постерная сессия на конференции ECCMID 2022, Лиссабон, Португалия.

Vittorio IvagneIvagnes et al. Прямое обнаружение генов резистентности к ß-лактамам из положительной культуры крови с помощью чипа для определения резистентности к грамотрицательным бактериям (система Molecular Mouse).

   Инфекция кровотока (ИК) - серьезное заболевание, которое может привести к генерализованной инфекции, множественной органной недостаточности и смерти. Быстрая идентификация возбудителя инфекции в положительных культурах крови (КК) (и их возможных маркеров резистентности) имеет решающее значение для своевременного начала эффективной антибиотикотерапии.

   По данным Европейского центра профилактики и контроля заболеваний, в 2021 году наиболее резистентными к одному или нескольким классам антибиотиков были следующие виды бактерий: E. coli (39,4%), K. pneumoniae (11,9%). β Лактамы являются одними из наиболее используемых препаратов для лечения ИК, вызванных грамотрицательными бактериями, однако резистентность к этим антимикробным препаратам выросла за последние десятилетия, представляя собой всемирную клиническую проблему. Различные коммерческие тесты нуклеиновых кислот для диагностики ИК могут сократить время идентификации генов резистентности и имеют дополнительную ценность для принятия решений о рациональном использовании антибиотиков, сокращая время до начала соответствующей и оптимальной антибиотикотерапии.

   Мы оценили эффективность платформы Molecular Mouse (производитель Alifax) с чипом для определения резистентности грамотрицательных бактерий (GNR) для выявления 9 генов резистентности к β-лактамазам blaIMP, blaCMY 2, группа blaCTX M 1\9, blaKPC, blaNDM, blaOXA-23 подобные, blaOXA-48 подобные, расширенные бета-лактамазы blaSHV, blaVIM) непосредственно из положительной культуры крови (ПКК).

Методы
   Для оценки чипа GNR мы использовали 4 вида бактерий (K. pneumoniae, P. aeruginosa, E. coli, A. baumannii) с общим количеством 60 образцов и 74 генами резистентности. Мы использовали архивные образцы из положительных КК на вышеупомянутые гены резистентности по 1,5 мл, смешанные со 100 мкл диметилсульфоксида и хранившиеся при 80 С, которые были предварительно исследованы с помощью системы BacTAlert (bioMérieux). 

   Кроме того, мы дополнили исследование положительными симулированными КК, чтобы увеличить количество генов резистентности для анализа. Для получения симулированных КК были взяты свежие колонии грамотрицательных бактерий, выросшие на чашках с агаром Макконки и суспендированные в фосфатном забуференном солевом растворе и инокулированы во флаконы КК с 8 мл консервированной человеческой крови. Инокулированные флаконы были инкубированы в системе BacTAlert до получения положительного сигнала. 200 мкл бульона положительных КК анализировали с помощью чипа GNR в соответствии с инструкциями производителя и результаты были получены через 1 ч. Результаты анализа GNR сравнивали с результатами ПЦР-амплификации и секвенирования субкультивированных изолятов в качестве референсного метода.

Результаты
   Всего в исследование было включено 58 положительных КК (56 мономикробных и 2 полимикробных). Анализ GNR правильно идентифицировал 74 (100%) из 74 β-лактамаз из 60 микроорганизмов, включая CMY (n=10), CTX M (n=16), KPC (n=13), NDM (n=9), OXA 23 (n=14), OXA 48 (n=5), ESBL SHV, (n=1), IMP (n=1) и VIM (n=5).

Таблица 1. Профили генов антимикробной резистентности видов микроорганизмов включенных в исследование.

Выводы
   Эти предварительные данные свидетельствуют о потенциальной целесообразности использования чипа GNR в качестве полезной альтернативы фенотипическому тестированию для быстрого выявления маркеров резистентности и могут стать важным подспорьем в оптимальном ведении пациентов в критическом состоянии. Необходимо увеличить количество образцов и провести дальнейшие исследования для более точной оценки эффективности.

Источник: Анналы Università Cattolica del Sacro Cuore Rome (Italy), 2022.

Vittorio Ivagnes et al. Быстрая идентификация видов Candida из положительных культур крови с помощью молекулярного анализа на картридже lab-on-chip.

Задачи:
   Кандидемия, в частности связанная с неальбикансными видами Candida, является причиной значительной заболеваемости и смертности, а также увеличения расходов на здравоохранение, связанных с длительным пребыванием в стационаре. В связи с продолжающейся тенденцией к увеличению числа вспышек Candida auris и C. parapsilosis своевременная идентификация видов Candida в положительных культурах крови приобретает решающее значение для ведения пациентов и остается сложной задачей.

   Целью настоящего исследования была оценка недавно разработанной платформы Molecular Mouse (производитель Alifax S.r.l.) на чипе в режиме реального времени для выявления клинически значимых видов Candida непосредственно из положительных культур крови.

Материалы и методы:
   Мы оценили анализ на чипе Yeast Blood (YBL) в сочетании с собственным протоколом выделения ДНК на 106 положительных культурах крови (КК) (63 симулированных и 43 реальных КК). В частности, сначала анализ был проведен на 7 смоделированных КК, включающих каждый из следующих видов Candida: C. albicans, C. glabrata, C. parapsilosis, C. tropicalis, C. krusei, C. auris, C. guillermondii, C. lusitaniae и C. dubliniensis. Затем анализ был проведен на 43 реальных положительных КК и сравнен с результатами, полученными с помощью MALDI-TOF-идентификации.

Результаты:
   Молекулярный анализ на чипе в режиме реального времени позволил нам идентифицировать все виды Candida, инокулированные в симулированных положительных КК, за исключением C. lusitaniae, менее чем за два часа. Что касается реальных положительных КК, система смогла обнаружить 19 C. albicans, 13 C. parapsilosis, 9 C. glabrata и 2 смешанные КК C. albicans плюс C. parasilosis в полном соответствии с идентификацией с помощью масс-спектрометрии MALDI-TOF.

Выводы:
   Наши результаты показывают, что молекулярный анализ с помощью картриджа lab-on chip может быть надежным и быстрым методом идентификации видов Candida в положительных КК. Дальнейшие эксперименты позволят оценить эффективность анализа и лучше определить его роль в рабочем процессе диагностической лаборатории.

Рис. 1. Основные этапы методики выделения ДНК Candida.

Источник: Trends in Medical Mycology, 2022.

Более подробно о системе Molecular Mouse - в нашем каталоге.

Технологии секвенирования нового поколения и другие технологии секвенирования в диагностической микробиологии и диагностике инфекционных заболеваний (полный текст статьи)

За последние несколько десятилетий использование технологий секвенирования следующего поколения (NGS) в клинической диагностике расширилось. 

   Технологии NGS (next generation sequencing) позволяют проводить массовое параллельное секвенирование миллионов фрагментов ДНК с высокой пропускной способностью. В области диагностики генетических заболеваний и рака эти технологии стали золотым стандартом диагностики. Только в последнее десятилетие, когда эти технологии NGS стали более доступными, их использование в лаборатории клинической микробиологии стало реальностью.

   Современные технологии NGS могут быть использованы в трех различных областях клинической микробиологической лаборатории: 

- секвенирование всего генома (WGS- whole genome sequencing), 

- целевое секвенирование метагеномов и 

- метагеномное секвенирование методом "дробовика".

 В данном обзоре мы проанализируем эти три области применения и представим исчерпывающую информацию о том, как они используются в настоящее время в здравоохранении, фундаментальных исследованиях и лабораториях клинической микробиологии. Эти приложения нелегко внедрить в лабораторию, поэтому мы подчеркиваем важные факторы, которые необходимо учитывать при внедрении этих технологий. Тем не менее, эти технологии уже изменили ландшафт обычной лаборатории клинической микробиологии, и мы обсуждаем, что, по нашему мнению, возможно для этих технологий в диагностике инфекционных заболеваний в ближайшие 5 лет.(Статья опубликована в 2022 г. - прим.пер.).

Эволюция технологий секвенирования

   За последние 60 лет технологии секвенирования стремительно развивались, начав с секвенирования первого поколения и развившись до современных технологий секвенирования третьего поколения (табл. 1). Зарождение секвенирования первого поколения произошло одновременно, когда Фредерик Сэнгер и Аллан Максам и Уолтер Гилберт опубликовали свои протоколы, описывающие способы секвенирования ДНК. 

   Метод секвенирования Максама-Гилберта был основан на химическом разрушении, когда радиомеченную ДНК обрабатывали различными химическими веществами, чтобы разорвать цепь на определенных основаниях. Затем эти фрагменты прогоняли в полиакриламидном геле, чтобы определить положение интересующего нуклеотида. Сэнгер предложил метод обрыва цепи, который предполагает использование химических аналогов дезоксинуклеотидов (dNTPs), известных как дидезоксинуклеотиды (ddNTPs), которые предотвращают дальнейшее удлинение цепи ДНК. Метод включает четыре параллельные реакции с ddNTPs, которые проводятся в полиакриламидном геле для интерпретации того, какое основание присутствует в нуклеотидной последовательности. 

Именно усовершенствования метода Сэнгера, такие как переход на флуорометрическую детекцию и детекцию с помощью капиллярного электрофореза, позволили продвинуть секвенирование ДНК до автоматизированных приборов для секвенирования ДНК.

   Второе поколение технологий секвенирования появилось, когда вместо радиомеченых или флуоресцентно меченых нуклеотидов исследователи стали измерять с помощью люминесценции синтез пирофосфата для определения последовательности нуклеотидов. Этот метод, известный как "пиросеквенирование", и приборы, созданные для проведения пиросеквенирования, позволили проводить параллельные реакции секвенирования, что увеличило количество ДНК, которое можно секвенировать за один прогон. 

   Развивались и другие методы параллельного секвенирования, включая секвенирование с помощью системы лигирования и детекции олигонуклеотидов (SOLiD, Applied Biosystems), которое секвенирует ДНК путем лигирования, и метод секвенирования Ion Torrent, который измеряет разницу в рН, вызванную высвобождением протонов при полимеризации. Наиболее заметным и успешным из этих методов секвенирования второго поколения является метод секвенирования с мостовой амплификацией, который первоначально применялся компанией Solexa, а затем был приобретен компанией Illumina. В этом методе фрагментированная ДНК, меченная адаптером, проходит над участком комплиментарных олигонуклеотидов, закрепленных на проточной кювете. После связывания твердофазная полимеразная цепная реакция (ПЦР) создает кластеры клональных популяций из каждой отдельной исходной нити ДНК, связанной с проточной кюветой. Первый из этих приборов Illumina Genomic Analyzer был способен производить только очень короткие чтения, но он генерировал парные данные с последовательностью на каждом конце. Эти парные данные предоставляют больший объем информации, что обеспечивает большую точность при меньших фоновых помехах по сравнению с другими методами второго поколения.

   До сих пор нет единого мнения о том, что определяет разницу между технологиями секвенирования второго и третьего поколения, но для целей данного обзора мы определяем секвенирование третьего поколения как возможность проведения секвенирования одной молекулы. Технологии одномолекулярного секвенирования не требуют этапов амплификации ДНК, что позволяет повысить пропускную способность, ускорить время выполнения теста и увеличить длину чтения. 

   Несколько компаний стали лидерами в разработке технологий секвенирования третьего поколения, и две наиболее заметные из них - Pacific Biosciences (PacBio, США) и Oxford Nanopore Technologies (Великобритания). Метод PacBio измеряет включение ДНК-полимеразой флуоресцентно меченых нуклеотидов в шаблон комплементарной последовательности. В центре этой технологии находится плотный массив наноструктур с нулевой длиной волны (ZMW - zero-mode wavelength). Эти ZMW-наноструктуры позволяют измерять отдельные флуоресцентно меченные нуклеотиды в режиме реального времени и за короткий промежуток времени. Эта технология способна производить очень длинные чтения длиной до 10 килобаз (кб). Метод Oxford Nanopore Technologies использует нанопоры, как биологические, так и твердотельные, встроенные в мембрану с ионным током. Одноцепочечная геномная ДНК или РНК может проходить через нанопоры, и каждое отдельное нуклеотидное основание физически блокирует ток, который может быть измерен с помощью стандартных электрофизиологических методов.

   Что касается современной клинической микробиологической диагностики, то для идентификации бактериальных и грибковых видов по прямому росту колоний часто используется технология секвенирования по Сэнгеру первого поколения. Для идентификации бактерий используются гены 16S рибосомальной РНК (рРНК) и β-субъединицы ДНК-зависимой РНК-полимеразы (rpoB), а для грибов - гены рибосомального внутреннего транскрибируемого спейсера (ITS - internal transcribed spacer) и 28S рРНК.

   В настоящее время новые поколения секвенирования (второе и третье) изучаются для использования в клинической микробиологии для идентификации интересующих патогенных организмов. Существует два основных способа достижения этой цели: первый - это улучшение идентификации растущих в культуре организмов с помощью секвенирования всего генома (WGS - whole-genome sequencing). Второй - использование метагеномного секвенирования для идентификации потенциальных патогенных организмов непосредственно из источника, чтобы обойти процесс культивирования и/или улучшить результат. В данном обзоре будут рассмотрены оба эти направления.

3. Полногеномное секвенирование микроорганизмов

   Секвенирование всего генома (WGS) - это процесс секвенирования и сборки микробного генома интересующего организма. Эти микробные геномы могут принадлежать бактериям, грибам и вирусам. 

WGS для бактерий, микобактерий и грибковых организмов требует культивирования и выделения организма перед выделением нуклеиновых кислот и последующим построением последовательности.

   Это является ограничением для организмов, которые трудно или невозможно вырастить в культуре. В случае вирусных геномов WGS используется путем секвенирования непосредственно образца в отношении интересующего вирусного генома, что будет рассмотрено далее в разделе о метагеномном секвенировании.

   Для WGS используются технологии секвенирования второго поколения (например, Illumina) или третьего поколения (например, PacBio или Nanopore), преимущества и недостатки которых более подробно описаны в других источниках. Существует множество нюансов того, как получить чистую культуру организма от культуральной чашки до конечных результатов секвенирования с помощью технологий обоих поколений, но в целом рабочий процесс одинаков (рис. 1). 

   Вкратце, сначала организм извлекается из культуральной чашки и из него выделяется ДНК. После извлечения ДНК создается библиотека, в которой ДНК каждого отдельного организма разрезается на фрагменты и снабжается адаптерами, содержащими уникальный штрих-код, что позволяет проводить мультиплексирование сотен образцов. Эти индивидуальные библиотеки объединяются вместе и передаются в выбранную технологию NGS. После завершения секвенирования проводится биоинформатика для демультиплексирования образцов, затем выполняется фильтрация качества и удаление адаптеров. 

   Затем существует три способа сборки генома для получения идентификации с помощью WGS. Первый известен как референсная сборка, при которой фрагменты ДНК выравниваются по известному референсному геному и получается консенсусный геном, как пазл. Второй - сборка de novo, при которой все фрагменты ДНК собираются в контиги. (Контиг, от англ. contiguous, представляет собой набор перекрывающихся сегментов ДНК, которые в совокупности представляют собой консенсусную область ДНК. В задаче сборки генома контиги представляют собой продолжительные участки ДНК (строки из нуклеотидов), полученные в процессе сборки - прим.пер.). При сборке de novo трудно получить геномы высокого качества, поэтому более популярным третьим конвейером сборки является гибрид сборки de novo и эталонной сборки, когда фрагменты ДНК собираются в контиги, а затем эти контиги сопоставляются с эталонными геномами.

Рисунок 1. Обзор рабочих процессов секвенирования. (a) Полногеномное секвенирование - этот рабочий процесс начинается с получения колонии интересующего микроорганизма. Затем ДНК выделяется, фрагментируется и помещается в библиотеку для подготовки к секвенированию по методу Сэнгера или для других методов NGS. Затем библиотека секвенируется и анализируется с помощью биоинформационного конвейера. (b) Таргетное секвенирование - этот рабочий процесс начинается с клинического образца и включает в себя процесс отбора или обогащения перед подготовкой библиотеки в случае бактерий и грибов. Если интересующим патогеном является вирус, отбор или обогащение происходит после подготовки библиотеки. Затем подготовленные образцы секвенируются и анализируются с помощью биоинформационного конвейера. (c) Секвенирование по методу "дробовика" - этот процесс похож на процесс WGS, но вместо колонии интересующего микроорганизма ДНК или РНК выделяется непосредственно из представленного клинического образца. Выделенная ДНК или РНК проходит через подготовку библиотеки и затем секвенируется. Полученные результаты анализируются с помощью биоинформатики.

   WGS микроорганизмов, которые можно культивировать и выделять, может быть использована для идентификации организма, типирования организма в эпидемиологических целях и выявления возможной резистентности организма к антимикробным препаратам. Традиционные методы клинической микробиологии для начальных этапов идентификации культивируемых бактерий включают основные морфологические наблюдения, биохимические тесты и идентификацию с помощью матрично-ассистированной лазерной десорбции-ионизации времяпролетной масс-спектрометрии (MALDI-TOF MS); последний метод по-прежнему очень точен и быстр по сравнению с WGS. 

   Однако бывают случаи, когда MALDI-TOF MS не позволяет уверенно определить видовую принадлежность, особенно в случае с прихотливыми организмами и анаэробными бактериями. В большинстве случаев достаточно идентификации до уровня рода, но есть случаи, когда видовая идентификация является обязательной из-за различий в профиле чувствительности к антибиотикам между видами. 

   Например, Enterococcus faecium и Enterococcus faecalis имеют два разных профиля чувствительности к антибиотикам, что имеет клиническое и эпидемиологическое значение. E. faecium обладает резистентностью к ампициллину, и этот вид энтерококков имеет высокий уровень резистентности к ванкомицину, в то время как у E. faecalis и то, и другое встречается относительно редко. С помощью MALDI-TOF MS удается очень точно идентифицировать эти два вида Enterococcus, но это всего лишь крайний пример, показывающий, что идентификация до рода не всегда является достаточной.

   Современные методы микробиологической идентификации не позволяют определить серотип бактерии, что очень важно в случаях инфицирования сальмонеллами, когда для лечения очень важно выявить серотип возбудителя. В настоящее время в США идентификация серотипа сальмонелл с помощью WGS проводится в лабораториях общественного здравоохранения. До появления WGS лаборатории использовали импульсный полевой гель-электрофорез (PFGE - pulse-field gel electrophoresis) для идентификации серотипов Salmonella, но сравнительные исследования WGS показали, что он сопоставим с PFGE и WGS стал золотым стандартом. 

   Существует множество различных биоинформационных подходов, которые используются вместе с WGS для типирования конкретного изолята, и один из основных подходов известен как мультилокусное типирование последовательностей (MLST- multi-locus sequence typing). Этот подход использует набор "домашних" генов (5-7 генов в зависимости от бактерии) для конкретного вида бактерий и использует мутации в этих генах для сравнения степени родства одного бактериального изолята с другим. 

   MLST с выделением типов последовательностей (ST - sequence type) долгое время был золотым стандартом для типирования организмов с помощью WGS-анализа. Однако в 2014 году Leekitcharoenphon et al. использовали несколько типов биоинформационных анализов, чтобы сравнить различные методы типирования WGS с PFGE для кластеризации вспышек. Они сравнили 18 изолятов Salmonella enterica серовара Typhimurium из шести различных вспышек с помощью PFGE и четырех различных биоинформационных подхода к типированию и обнаружили, что анализ однонуклеотидных полиморфизмов (SNP - single nucleotide polymorphism) был методикой, способным кластеризовать 18 изолятов в соответствующие кластеры вспышек со 100% совпадением. 

Хотя этот метод не является золотым стандартом, все больше лабораторий отдают предпочтение SNP-анализу для эпидемиологического отслеживания потенциальных вспышек, поскольку при таком анализе учитывается весь геном, а не только несколько отдельных генов.

   В США результаты WGS, полученные лабораториями общественного здравоохранения, курируются и поддерживаются PulseNet, которая представляет собой сеть лабораторий общественного здравоохранения и агентств по контролю качества пищевых продуктов, координируемую Центрами по контролю заболеваний (CDC). Основная задача этой сети - помочь выявить и расследовать потенциальные вспышки в системах производства и распространения пищевых продуктов, что является основной инициативой подхода CDC, известного как One Health. Помимо вышеупомянутой идентификации серотипов Salmonella, PulseNet также проводит WGS для подтипирования и идентификации следующих микроорганизмов: Escherichia coli (O157 и другие E. coli, продуцирующие токсин Шига), Campylobacter, Listeria monocytogenes, Shigella, Vibrio cholerae, Vibrio parahaemolyticus и Cronobacter.

   Идентификация серотипов при вспышках заболеваний пищевого происхождения - не единственная область применения WGS в здравоохранении. WGS также используется для эпиднадзора за заболеваниями, предотвращаемыми с помощью вакцин, такими как серогруппы Neisseria meningitidis, серотипы Streptococcus pneumoniae и патогены, резистентные к антимикробным препаратам, такие как Mycobacterium tuberculosis с множественной лекарственной устойчивостью. Одним из заболеваний, предупреждаемых вакцинацией, требующим постоянного мониторинга, является N. meningitidis, поскольку ежегодно происходят многочисленные вспышки. Возможность определить серогруппу и провести WGS изолятов N. meningitidis является ключевым фактором для оказания помощи в сфере общественного здравоохранения, чтобы определить, начинается ли вспышка и необходимы ли меры общественного здравоохранения, такие как массовая вакцинация.

   В фундаментальных исследованиях WGS использовали для характеристики изолятов стрептококка группы В (GBS) серотипа IV, выделенных при инвазивных заболеваниях новорожденных, возникших в США и Канаде. Изоляты GBS серотипа IV имеют разнообразный генетический фон, включающий несколько различных ST и клональных комплексов (КК). Интерес представляет высоко распространенная линия ST-452, отнесенная к клональному комплексу CC23, описанному в нескольких странах. WGS и филогенетический анализ основного генома позволили предположить, что ST-452 могла возникнуть в результате генетической рекомбинации с исходным событием и штаммом-основателем, возникшим в результате переноса одного гена между CC23 и гипервирулентной линией CC17. Хромосомное картирование основных факторов вирулентности GBS показало, что штаммы ST-452 имеют уникальный профиль среди штаммов CC23 и CC17. Конъюгация и гомологичная рекомбинация с обменом крупными хромосомными фрагментами, охватывающими сотни килобаз, считаются одним из основных событий, контролирующих непрерывную эволюцию GBS. Резистентность к антимикробным препаратам у GBS также изучалась методом WGS с исследованием большого количества изолятов GBS, колонизирующих беременных женщин.

   Большинство изолятов GBS серотипа IV в этом исследовании были ST-459, резистентными к тетрациклину, эритромицину и клиндамицину, впервые обнаруженными в Миннесоте, США, которые считаются основным фактором распространения GBS серотипа IV в Северной Америке. WGS-исследования рекомбинационных событий выявили многочисленные эпизоды капсульного перехода среди этих изолятов. Поразительное генетическое разнообразие и продолжающаяся эволюция GBS убедительно подтверждают необходимость текущего и будущего геномного мониторинга среди всех 10 серотипов GBS, поскольку полученная информация может оказать большое влияние на разработку вакцин против GBS.

 В клинической лаборатории WGS доказал свою ценность в программах профилактики госпитальных инфекций, поскольку позволяет выявлять и отслеживать вспышки в пределах стационара.

   В значительной части опубликованных работ WGS использовалась для отслеживания вспышек наиболее распространенных нозокомиальных патогенов - метициллин-резистентного золотистого стафилококка и Clostridiodes difficile. WGS помогла отследить вспышки таких тяжелых организмов с множественной лекарственной резистентностью, как резистентная к карбапенемам Klebsiella pneumoniae, резистентный к ванкомицину Enterococcus faecium и резистентная к множеству лекарственных препаратов Acinetobacter baumannii.

   В больничных условиях бывают случаи, когда вспышки вызываются более прихотливыми организмами, и WGS используется для идентификации и эпидемиологического отслеживания этих прихотливых организмов, таких как Mycobacterium chimaera. Еще в середине 2010-х годов наблюдался рост заболеваемости инвазивными инфекциями M. chimaera у лиц, ранее перенесших операцию на открытой грудной клетке. Эти изоляты M. chimaera были секвенированы и оказались генетически и эпидемиологически связаны с контаминацией водонагревателей-охладителей, использовавшихся при кардиохирургических операциях у этих пациентов. Эти инфекции не были единичными случаями, поскольку такие водонагреватели-охладители были распространены по всему миру. В этих опубликованных случаях WGS проводился в ответ на подозрение о вспышке инфекции, но можно представить, что по мере повышения эффективности и рентабельности технологии госпитальные инфекционные программы смогут использовать эти технологии в своих диагностических микробиологических лабораториях для мониторинга и предотвращения будущих вспышек.

Как видно из нескольких примеров, приведенных выше, WGS может не только обеспечить идентификацию и эпидемиологическое отслеживание организмов, но и дать полный профиль присутствующих генов резистентности к противомикробным препаратам. 

   Современные методы выявления антимикробной резистентности - это либо фенотипические методы, зависящие от культуры, либо быстрые молекулярные методы, не зависящие от культуры. Культурно-зависимые фенотипические методы зависят от роста организма для интерпретации потенциальной резистентности, а культурно-независимые методы могут выявить только несколько основных маркеров генов резистентности. 

   Возможность получить полный генотипический профиль антимикробной резистентности организма позволяет получить более полный отчет о потенциальных механизмах антимикробной резистентности, присутствующих в организме. Существует множество опубликованных отчетов, которые показывают перспективность использования WGS для прогнозирования антимикробной резистентности для обычных микроорганизмов, таких как E. coli, S. aureus, Enterococcus faecium, Pseudomonas aeruginosa и Neisseria gonorrhoeae. Основной темой всех этих сообщений была способность генотипического прогнозирования резистентности с помощью WGS соответствовать фенотипической резистентности, зависящей от культуры, что является обязательным условием даже для рассмотрения возможности использования WGS вместо существующих методов. Однако современное состояние технологии WGS не позволяет полностью заменить существующие методы, а скорее дополнить их.

   В настоящее время WGS занимает больше времени по сравнению с традиционными культурально-зависимыми и культурально-независимыми методами для обычных организмов, упомянутых выше. В случае, когда WGS может сразу же оказать влияние на прогнозирование резистентности к противомикробным препаратам, речь идет об организмах, которые долго выращиваются или для которых тестирование на чувствительность к противомикробным препаратам является трудоемким, как, например, для N. gonorrhoeae, о которых говорилось ранее, а также для видов Mycoplasma и Ureaplasma

   Еще одна группа труднорастущих организмов, где WGS может помочь ускорить выявление резистентности к противомикробным препаратам, - это медленно растущие микобактерии, такие как Mycobacterium tuberculosis с множественной лекарственной резистентностью. В одном крупном исследовании, известном как Comprehensive Resistance Prediction for Tuberculosis: An International Consortium (CRyPTIC), было проанализировано более 10 000 изолятов M. tuberculosis, и было установлено, что генотипический прогноз для препаратов первого ряда против туберкулеза коррелирует с фенотипической чувствительностью >90%. 

   Недавнее исследование подтвердило, что WGS может значительно сократить время выполнения традиционного анализа на чувствительность к противомикробным препаратам, который может занимать до месяца. Еще один профиль резистентности микобактерий к противомикробным препаратам, где WGS может быть полезен, - это Mycobacteroides abscessus (ранее Mycobacterium abscessus), которая может обладать индуцируемой резистентностью к кларитромицину, а золотым стандартом для выявления этой резистентности является инкубация бульонных микроразведений в течение 14 дней. Одна из групп подтвердила и внедрила WGS-тест, позволяющий предсказать эту индуцированную устойчивость к кларитромицину, а также резистентность к амикацину всего за 3-5 дней по сравнению со стандартом в 14 дней. Такие случаи уменьшения времени выполнения теста облегчат врачам лечение таких сложных случаев.

   Одним из недостатков выявления резистентности к противомикробным препаратам с помощью WGS является то, что выявляются только известные гены резистентности и мутации. Однако продолжение секвенирования организмов с множественной лекарственной резистентностью может привести к открытию новых генов резистентности и механизмов резистентности. Более того, многие группы работают над созданием программ машинного обучения для поиска резистентности к противомикробным препаратам.

   Использование WGS для идентификации грибов в клинической диагностике менее обосновано, чем для идентификации бактерий, но можно увидеть, где это может быть более выгодно по сравнению с существующими морфологическими методами идентификации в микологии, которые могут быть субъективными. В одном из исследований было показано, что корреляция между фенотипической идентификацией, использующей микроскопическую и колониальную морфологию и физиологические исследования, и секвенированием области D2 большой субъединицы гена рРНК и полных областей ITS многих распространенных и редких клинически значимых плесеней составляет приблизительно 50%. 

   WGS использовался в нескольких расследованиях вспышек контаминации лекарственных препаратов, например в Чили и Колумбии, где препарат против тошноты был контаминирован Sarocladium kiliense, который вызвал инфекции кровотока у людей. Другим примером вспышек грибковых заболеваний, вызванных контаминацией медикаментов, является Exserohilum rostratum. Более 13 000 пациентов получили различные виды инъекций (эпидуральные, параспинальные и суставные) контаминированным ацетатом метилпреднизолона (MPA). WGS удалось связать эти случаи и отследить контаминацию до трех партий контаминированного MPA.

   Одним из наиболее заметных примеров использования WGS для идентификации грибов и эпидемиологического отслеживания является появление грибков с множественной лекарственной резистентностью - Candida auris. Сообщалось, что C. auris вызывает смертельные инфекции и вспышки в больницах и учреждениях длительного ухода по всему миру. Известно, что C. auris трудно идентифицировать стандартными лабораторными методами из-за его сходства по внешнему виду и биохимическим характеристикам с другими кандидами. Обычные биохимические тесты обычно ошибочно идентифицируют C. auris как Candida haemulonii, а также с другими грибками, такими как Candida parapsilosus и Rhodatorula spp.. Существует обогащенный бульон, который можно использовать для преодоления ошибочной идентификации C. auris; однако для этого требуется 21 день инкубации с последующим получением агаровой культуры. Результаты WGS  были использованы для подтверждения идентичности возбудителя и эпидемиологического мониторинга по всему миру.

   Прогнозирование резистентности к противогрибковым препаратам с помощью WGS изучается у грибков, таких как Candida, но до недавнего времени не было опубликовано исследований по прогнозированию резистентности к противогрибковым препаратам грибков с помощью WGS. Тем не менее, многочисленные изоляты аскомицетного грибка Aspergillus fumigatus были исследованы с помощью WGS для изучения доминирующего механизма резистентности при мутациях гена, кодирующего белок, на который направлено действие триазольных противогрибковых препаратов. 

   WGS было проведено для 24 изолятов, как резистентных к азолам, так и чувствительных к ним, полученных из клинических и экологических источников из нескольких стран. Биоинформационный анализ SNPs высокого разрешения подтвердил мутацию TR34/L98H как единственный механизм резистентности к азолам. Используя этот подход, расширенные исследования 218 изолятов A. fumigatus, как клинических, так и из окружающей среды, из Великобритании и Ирландии, были изучены методом WGS для определения молекулярной эпидемиологии грибка и выяснения, происходит ли приобретение лекарственно-устойчивых изолятов группами риска. 

   Анализ данных подтвердил, что изоляты, резистентные к азолам, передаются из окружающей среды. Эти данные были использованы для проведения геномных исследований ассоциаций (GWAS - genome-wide association studies) и пангеномного анализа с целью выявления вариаций, связанных с резистентностью к итраконазолу, что позволило обнаружить потенциально новые механизмы резистентности, имеющие полигенную основу. Приведенные выше примеры иллюстрируют возможности WGS в изучении Aspergillus и резистентности к противогрибковым препаратам, однако существует множество примеров скоплений клинически значимых грибов в условиях клиники, где эта технология потенциально может раскрыть важные эпидемиологические проблемы инфицирования и распространения, а также резистентности к противогрибковым препаратам. Необходимо провести работу по изучению и внедрению в лабораториях соответствующих методов идентификации грибов с помощью WGS. 

Полезной будет не только идентификация и эпидемиологическая информация, но и прогнозирование резистентности к противогрибковым препаратам с помощью WGS - это логичный следующий шаг, который может реально улучшить лечение грибковых инфекций.

   Когда речь заходит о внедрении NGS-технологий в лаборатории клинической микробиологии, непосредственным применением NGS-технологии является WGS. WGS колоний непосредственно из культуры позволяет получить обширные знания, сопоставимые с обычным микробиологическим рабочим процессом. Однако WGS обеспечивает не только стандартную идентификацию и прогнозирование резистентности к противомикробным препаратам, но и возможность сравнения изолятов между собой для выявления вспышек заболеваний. Мы считаем, что внедрение WGS - это возможный первый шаг к внедрению NGS в лабораторию, поскольку он дополняет, а в некоторых случаях и улучшает обычный рабочий процесс микробиологической лаборатории.

4. Метагеномное секвенирование непосредственно образца

   Если говорить о будущем NGS в клинической микробиологии, то главным преимуществом секвенирования метагеномов непосредственно из клинического образца является полное исключение процесса культивирования. Это может значительно сократить время выполнения исследований и предоставить медицинским работникам более своевременные ответы. 

   Существует два различных NGS-подхода к секвенированию метагеномов, которые могут быть использованы для обнаружения патогенов непосредственно из клинического образца (рис. 1). Первый - это процесс обогащения, известный как глубокое ампликонное или целевое секвенирование, при котором к выделенной ДНК применяются специфические праймеры для амплификации нужной группы патогенов (например, бактерий или грибов) или одного конкретного патогена, представляющего интерес (например, ВИЧ, SARS-CoV-2). 

   Второй подход известен как секвенирование методом дробовика (shotgun metagenomics), когда секвенируется вся выделенная ДНК или РНК из клинического образца, а работа по определению потенциального патогена выполняется в биоинформационном конвейере. Такой подход позволяет расширить сеть для поиска потенциальных патогенов, представляющих интерес. 

   В настоящее время еще нет одобренных Управлением по контролю качества пищевых продуктов и лекарственных средств США (FDA) NGS-тестов для любого из этих подходов. Подобно WGS-тестам в лабораториях общественного здравоохранения, существуют лаборатории, сертифицированные в соответствии с Поправками к закону о совершенствовании клинических лабораторий (CLIA), в которых разработаны лабораторные тесты для прямого метагеномного секвенирования образцов. Существует несколько коммерческих вариантов метода дробовика, которые будут рассмотрены ниже.

   4.1. Целевое (таргетное) секвенирование

   Целевое секвенирование - это метод секвенирования, при котором процесс отбора или обогащения проводится для интересующего организма или группы организмов либо до, либо после процесса подготовки библиотеки (рис. 1). Существует несколько методов, которые могут быть использованы для выделения конкретного организма или группы организмов, представляющих интерес, и они включают в себя: ПЦР-амплификация и гибридизация зондов. Преимущество всех этих методов заключается в меньшем вмешательстве человеческой ДНК и более высокой чувствительности обнаружения в образцах с большим количеством человеческих клеток (например, в тканях или мокроте). Основным недостатком этих методов направленного секвенирования является ограниченное число патогенов, которые можно обнаружить. Целевое секвенирование непосредственно из образцов проводилось с использованием технологических платформ второго и третьего поколения.

   ПЦР-амплификацию при целевом секвенировании также называют глубоким ампликонным секвенированием. Глубокое ампликонное секвенирование - это расширение технологии ПЦР, обеспечивающее более глубокий охват интересующего гена (генов). Наиболее известными применениями глубокого ампликонного секвенирования являются амплификация гена 16S рибосомальной РНК (16S рРНК) для идентификации бактерий и 28S рРНК или рибосомальных генов ITS для идентификации грибов.

   Многие лаборатории утвердили и внедрили тесты для глубокого ампликонного секвенирования с идентификацией как бактерий, так и грибов, а одна группа даже продемонстрировала полезную схему, включающую оба метода. Кроме того, глубокое ампликонное секвенирование 16S облегчило идентификацию более трудно выращиваемых организмов, включая клещевые бактерии, которые обычно не обнаруживаются в обычных бактериальных культурах (например, Borrelia, Anaplasmsa, Ehrlichia и Rickettsia). 

   В частности, амплификация гена 16S была продемонстрирована в клинических условиях для различных типов образцов, включая суставную жидкость, кровь и спинномозговую жидкость (ЦСЖ). В случае перипротезных инфекций суставов (ППИС) обычная чувствительность бактериальной культуры, как известно, несовершенна из-за того, что пациенты получали предыдущие курсы антимикробной терапии. Было проведено сравнительное исследование пациентов с подозрением на ППИС для сравнения чувствительности целевого 16S-секвенирования с обычным бактериальным посевом, чтобы определить, улучшилась ли идентификация микроорганизма, вызвавшего инфекцию. 

   В общей сложности 47 ППИС локтевого сустава были положительными при секвенировании, и четыре из них (8%) были отрицательными при культивировании и положительными при целевом 16S-секвенировании. Всего было восемь случаев расхождения результатов между традиционной бактериальной культурой и целевым 16S-секвенированием, и они были получены в образцах ППИС, которые представляли собой полимикробные инфекции. В четырех случаях целевое 16S-секвенирование выявило дополнительные патогены. Эти данные отражают ценность и сложность целевого 16S-секвенирования, способного предоставить дополнительную информацию о таких ППИС, особенно в случаях, когда они являются культурально-негативными. Это исследование было проведено ретроспективно, но можно представить, что дополнительная информация, полученная в результате целевого 16S-секвенирования, могла бы изменить результаты терапии и состояние пациента.

   Прямое глубокое ампликонное секвенирование образцов для идентификации грибов было изучено в ограниченной степени на свежих образцах и показало определенный успех. Однако единственный тип образцов, где глубокая ампликонная амплификация грибов показала свою перспективность и большую клиническую пользу, - это ткани с парафиновыми вкраплениями, фиксированные в формалине (FFPE). 

   Одним из традиционных методов выявления инвазивных грибковых инфекций является микроскопическая визуализация грибковых элементов в тканях FFPE в сочетании с положительным результатом культивирования. Однако нередки случаи, когда грибковые элементы обнаруживаются в тканях FFPE, но результат культивирования отрицательный или культура не была поставлена, поскольку это могла быть случайная находка. Кроме того, грибковые элементы, обнаруженные в тканях FFPE, могут быть неправильно идентифицированы в 21% случаев. Глубокое ампликонное секвенирование грибков в тканях FFPE может предложить врачам точную идентификацию увиденных организмов и позволить им применить правильный вариант противогрибковой терапии. В частности, было показано, что глубокое ампликонное секвенирование ITS позволяет идентифицировать грибковые элементы, обнаруженные в тканях FFPE, даже если на слайде присутствовало менее 50 грибковых организмов.

  Метод глубокого ампликонного секвенирования используется в клинической вирусологической диагностике, в частности для определения резистентности к противовирусным препаратам у цитомегаловируса (ЦМВ) и вируса иммунодефицита человека (ВИЧ). Оба вируса имеют хорошо известные мутации в своих геномах, которые придают устойчивость к специфическим для каждого вируса противовирусным препаратам и подробно рассмотрены в других источниках. Коммерческое выявление известных маркеров резистентности к противовирусным препаратам с помощью секвенирования для ЦМВ - это тест, выполняемый как компанией Viracor, так и ARUP Laboratories. Лишь компания Viracor предлагает тест для определения профиля устойчивости к противовирусным препаратам с помощью секвенирования для ВИЧ-1 в дополнение к генотипированию интегразы ВИЧ-1.

   Популярным подходом к целевому секвенированию, который используется при секвенировании генома человека, является обогащение зондов. В этом методе используются небольшие гибридизационные зонды, которые собираются в панели, включающие от 50 до миллионов зондов. В контексте секвенирования генома человека и панелей мутаций эти гибридизационные зонды добавляются к фрагментированной ДНК и обогащаются для выявления интересующих генов или мутаций. 

   Эта технология была усовершенствована для применения в клинической лаборатории с созданием панели гибридизации бактериальных зондов, известной как система секвенирования с захватом бактерий (BacCapSeq), и панели гибридизации вирусных зондов, известной как платформа секвенирования с захватом вирусов позвоночных (Virome Capture Sequencing Platform for Vertebrate Viruses (VirCapSeq-VERT). В настоящее время нет опубликованных работ, свидетельствующих о том, что эти специфические панели гибридизации зондов используются в клинической микробиологической диагностике.

   Метод гибридизации зондов использовался в здравоохранении для обнаружения и отслеживания важных глобальных вирусных патогенов. В частности, в случае с вирусом Зика этот метод помог выявить линию и провести эпидемиологическое отслеживание вируса во время вспышки в середине 2010 года. Успех с вирусом Зика помог перенести этот подход на текущую пандемию SARS-CoV-2. Многие лаборатории общественного здравоохранения внедрили метод обогащения зондов для секвенирования SARS-CoV-2 непосредственно из представленных образцов, чтобы определить вариант, циркулирующий в обществе. Пока нет единого мнения о том, существует ли клиническая необходимость в генотипировании SARS-CoV-2 на уровне вариантов, но метод обогащения зондов делает это более достижимой возможностью, если лаборатория располагает соответствующими возможностями.

   4.2. Секвенирование метагеномов методом дробовика 

   В отличие от целевого секвенирования, секвенирование метагеномов методом дробовика позволяет охватить более широкую сеть, поскольку секвенируются все нуклеиновые кислоты в образце (рис. 1). 

Секвенирование всех нуклеиновых кислот позволяет выявить почти все патогены, включая бактерии, грибы, вирусы и паразитов, с помощью одного теста. 

   Этот метод секвенирования был успешно применен для выявления инфекции в различных образцах, включая обычно стерильные источники, такие как ЦСЖ, кровь и суставная жидкость. Кроме того, было продемонстрировано, что он помогает обнаружить инфекционный агент в образцах, в которых присутствует собственный микробиом, например, в образцах дыхательных путей, желудочно-кишечного тракта и мочи. Одним из ограничений метагеномного секвенирования методом дробовика является фон или интерференция нуклеиновых кислот человека или микробиома резидента, что может быть особенно опасно в таких образцах, как ткани или дыхательные секреты.

   Этот подход был реализован в нескольких лабораториях в виде валидированного теста, и эти лаборатории служат клиническими референс-центрами для пациентов. Первая из них находится в сертифицированной по CLIA лаборатории клинической микробиологии Калифорнийского университета в Сан-Франциско и предлагает тест на метагеномное секвенирование ЦСЖ методом дробовика. Общая точность этого теста составляет 90%, а клиническая чувствительность и специфичность - 73% и 99% соответственно.

   Имеются сообщения о различных случаях, свидетельствующих о диагностической пользе этого теста в случаях, когда все другие традиционные диагностические тесты были отрицательными, включая случай нейроцистицеркоза, вызванного инфицированием Taenia solium, случай вируса Западного Нила и случай нейробруцеллеза. С помощью этого теста было проведено годичное проспективное многоцентровое клиническое исследование пациентов с клинической картиной энцефалита, менингита и миелита, целью которого было определить полезность теста для диагностики этих заболеваний. С помощью метода дробовика в ЦСЖ было выявлено больше патогенов, чем при традиционном прямом выявлении в ЦСЖ (культура, анализ на антигены или экспрессные молекулярные методы).

   Однако авторы не утверждают, что этот тест может заменить традиционные методы диагностики, но улучшить диагностический подход. Этот же метод метагеномного секвенирования был применен к другим жидкостям организма, включая абсцессы, суставную жидкость, перитонеальную жидкость, плевральную жидкость, бронхоальвеолярный лаваж (БАЛ) и мочу. Следует отметить, что в клинических лабораториях данного референс-центра нет возможности использовать данный метод секвенирования метагеномов методом дробовика для других биологических жидкостей. Единственный предлагаемый дробовой метагеномный тест - это исследование ЦСЖ.

   Существует несколько коммерческих компаний, которые взяли за основу методологию дробовика и создали коммерческие анализы для различных источников организма. Первый из них, о котором мы расскажем, - это тест Karius для крови/плазмы. Этот тест, называемый тестом на свободную от клеток ДНК микроорганизмов или неинвазивной жидкой биопсией, был впервые представлен на рынке диагностики инфекционных заболеваний в 2016 году. Он предназначен для неинвазивного выявления глубоко залегающих инфекций и инфекций кровотока. В одном образце крови можно обнаружить >1250 мишеней различных бактериальных, грибковых, ДНК-вирусов и эукариотических паразитов.

   В отчете для пациентов количество обнаруженных целей выражается в молекулах ДНК на микролитр (MPM). Результаты по обнаруженным мишеням представлены в графическом виде, что позволяет сравнить количество случаев обнаружения данной мишени программой Karius. В различных исследованиях было обнаружено и зарегистрировано более одной цели. Частота обнаружения нескольких патогенов различна, что подтверждается опытом авторов. Все мишени, обнаруженные в образце крови, представлены в иерархическом порядке, причем мишень с наибольшим содержанием, MPM, указана первой. Необходимо оценить результаты и использовать клиническое суждение, чтобы определить клиническую значимость некоторых обнаруженных мишеней. Показатели позитивности (%) для обнаруженных патогенов в представленных образцах варьируются в зависимости от возраста пациентов и от учреждения, но в среднем могут составлять 50-70%. При повышении дискриминации при заказе теста показатели позитивности могут быть более высокими.

   Среди исследований, оценивающих совпадение положительных результатов секвенирования по Karius с обычными культурами, есть исследование, в котором изучались 2000 образцов, протестированных Karius, и было отмечено 97% совпадение положительных результатов секвенирования с результатами посева крови у пациентов с сепсисом. Существует еще несколько различных исследований, одни проспективные, другие ретроспективные, с относительно небольшим количеством пациентов, в которых совпадение результатов тестирования Karius и культуры или рибосомного секвенирования варьировало от 58 до 100%. 

   Приведенные ниже два случая демонстрируют широту применения теста для некультивируемых и культивируемых микроорганизмов и показывают полезность теста Karius при клинических инфекционных заболеваниях. Некоторые конкретные данные и описание были изменены для обеспечения анонимности пациентов.

Описание случая №1.

   У маленького ребенка с синдромом Ди Джорджа через 2 недели после хирургического лечения порока сердца, все еще находившегося на аппарате ИВЛ, развились лихорадка и двусторонние легочные помутнения. Посевы крови и мокроты не выявили бактерий и грибов. Образец крови был отправлен на анализ по Karius, и через 48 часов был получен результат: 1365  MPM ДНК Pneumocystis jirovecii

   Пациенту была начата специфическая терапия против Pneumocystis jirovecii, состояние улучшилось, и он был отключен от аппарата ИВЛ. Через несколько дней анализ ПЦР на P. jirovecii в эндотрахеальном образце также оказался положительным. Последующий тест Karius через 2 недели был положительным на P. jirovecii в 65 MPM ДНК.

Описание случая №2.

   Ребенок поступил с недельной повышенной температурой >38 С. При осмотре был обнаружен ранее не выявленный шум в сердце - аортальная регургитация, а эхокардиограмма показала двустворчатый аортальный клапан с большими вегетациями и разрывом клапана. Первоначально рутинные культуры крови были отрицательными. Через 36 часов тест Karius в плазме крови показал наличие Kingella kingae с 1890 МРМ ДНК. Были начаты антибиотики, и пациенту была проведена экстренная замена аортального клапана. Повторный тест Karius через 16 дней дал положительный результат на Kingella kingae с 55 MPM ДНК. Аэробные культуры крови оказались положительными через 9 дней инкубации, и тот же микроорганизм был выделен и идентифицирован с помощью масс-спектрометрии MALDI-TOF и секвенирования 16S рРНК.

   Более поздние публикации о тесте Karius включают ретроспективный обзор использования теста в крупной детской больнице в Техасе, США. Авторы пришли к выводу, что в целом обычное микробиологическое исследование дает те же результаты, что и тест Karius, но с более коротким временем выполнения. Кроме того, у большинства пациентов при выявлении дополнительных микробных агентов с помощью теста Karius терапевтическое лечение не менялось. Напротив, проспективное исследование этого теста в сравнении с посевом крови и другими стандартными микробиологическими исследованиями у взрослых пациентов с лейкемией и фебрильной нейтропенией показало, что результаты теста Karius могли бы позволить более раннюю оптимизацию антимикробных препаратов у 47% пациентов.

   Это было сравнительно небольшое исследование, включавшее 55 пациентов, но при оценке клинических данных было установлено, что причиной лихорадки у 87% пациентов была инфекция. По мнению многих экспертов в области инфекционных заболеваний, ценность теста Karius заключается в обнаружении неожиданных, трудно выявляемых или трудно культивируемых патогенов. Примером может служить обнаружение Rhizopus у одного пациента в вышеупомянутом исследовании в двух разных временных точках, когда на культивирование и идентификацию грибов уходило несколько дней.

   Хотя повторное тестирование по Karius может быть проведено у пациента, оно обычно не повторяется, и нет контролируемых исследований, демонстрирующих преимущества серийного тестирования. В некоторых ситуациях, например при наличии трудно поддающегося лечению микроорганизма, вызывающего эндокардит или другие необычные инфекции, можно привести аргументы в пользу повторения теста, чтобы увидеть значительное снижение MPM после двух- или нескольких недель антимикробной терапии. Поскольку тест Karius очень дорог (2000 долларов за тест с дополнительными расходами, иногда значительными, в зависимости от учреждения), в некоторых медицинских центрах существуют процессы управления (например, консультации/проверка местными руководителями лабораторий в области диагностической микробиологии и инфекционных заболеваний взрослых и детей) для оценки необходимости проведения теста или любых последующих тестов Karius. Остается много нерешенных вопросов, касающихся использования и времени выполнения этого теста, значимости полимикробных результатов и того, насколько клинические результаты компенсируют высокую стоимость теста.

   Еще одним коммерчески разработанным метагеномным тестом по методу дробовика является Explify™ Respiratory, который выполняется преимущественно на БАЛах и был выпущен компаниями IDbyDNA и ARUP Laboratories в 2017 году. Выделение РНК и ДНК из образцов БАЛ сопровождается подготовкой библиотек комплементарной ДНК и NG-секвенирования ДНК и секвенированием на приборах NextSeq или NovaSeq (Illumina) с медианной глубиной секвенирования 3-5 миллионов чтений. Explify™ Respiratory позволяет обнаружить >900 бактериальных, грибковых и вирусных респираторных патогенов. Обнаружение микроорганизмов основано на порогах обнаружения, установленных в ходе исследований по контролю качества, и результаты представляются полуколичественно. Результаты также стратифицируются и сообщаются как потенциальные патогены или дополнительные микроорганизмы на основе известной патогенности. 

   Этот клинический метагеномный NGS-анализ был применен для изучения пневмонии у различных групп пациентов, особенно у детей и взрослых с ослабленным иммунитетом. У таких пациентов часто наблюдаются загадочные пневмонические процессы, на которые не всегда дают ответ обычные бактериальные и грибковые культуры, а также однократные или мультиплексные ПЦР-анализы. Примером его полезности является выявление пропущенных патогенов у иммунокомпрометированных детей с пневмонией. Ранее пропущенные предполагаемые микробные патогены были выявлены в 18 из 41 (44%) БАЛ этих детей с угрожающей жизни пневмонией, включая 7 из 11 (64%) детей с фатальными инфекциями. Анализ Explify™ Respiratory выявил один патоген у 12 детей (63%), два - у 5 (26%) и четыре патогена - у 1 (5%) пациента. У этого количества детей были обнаружены бактериальные (13), грибковые (7) и вирусные (3) патогены.

   Аналогичным образом, 30 иммунокомпрометированных взрослых с 31 эпизодом пневмонии прошли бронхоскопию и исследовали БАЛ с помощью теста Explify™ Respiratory, а результаты сравнивали с результатами традиционного микробиологического исследования (ТМИ). Окончательный микробиологический диагноз был поставлен в 11 случаях (35%) при использовании только ТМИ и в 18 случаях (58%) при использовании ТМИ и Explify™ Respiratory. Окончательный диагноз был поставлен в 20/31 случае (65%) только с помощью ТМИ и в 23/31 случае (74%) на основании ТМИ плюс Explify™ Respiratory, что не является большой разницей. Однако диагностическое преимущество анализа Explify™ Respiratory в основном заключалось в выявлении дополнительных бактериальных причин, а для диагностики грибковой пневмонии он оказался менее полезным в данном исследовании. Очевидно, что при интерпретации результатов Explify™ Respiratory, а также их значимости в контексте клинического состояния пациента необходимо руководствоваться клиническими суждениями. Иногда результаты анализа Explify™ Respiratory оказываются впечатляющими, но неожиданными; например, Pneumocystis jiroveccii (дрожжеподобный грибок) у пациента с ослабленным иммунитетом.

   Примером потенциальной диагностической и клинической ценности теста Explify™ могут служить два взрослых пациента с ослабленным иммунитетом, страдающих пневмонией и отрицательными результатами обычных микробиологических исследований, у которых методом клинической метагеномики в БАЛ были обнаружены только Pantoea agglomerans или Ewingella americana. Рентгенологические данные соответствовали пневмонической патологии. Хотя это относительно редкие организмы, они могли способствовать развитию патологии, описанной у пациентов с ослабленным иммунитетом. Для диагностики загадочных пневмонических процессов, особенно у пациентов с ослабленным иммунитетом, целесообразно сочетать стандартные микробиологические диагностические подходы с данным анализом, чтобы дополнить клинические решения.

   Наконец, коммерческая компания IDbyDNA расширила метагеномный подход, используемый в Explify™ Respiratory, на диагностику инфекций мочевыводящих путей с маркерами резистентности к противомикробным препаратам, и несколько соответствующих докладов были представлены на 32-м Европейском конгрессе по клинической микробиологии и инфекционным болезням, Лиссабон, Португалия, 23-26 апреля 2022 года. Эта панель идентификации патогенов в моче/антимикробной резистентности позволяет выявить >190 патогенов, включая 135 бактерий, 35 вирусов, 14 грибков и 7 паразитов, а также >2000 маркеров антимикробной резистентности. Ожидается, что дальнейшие подробности из рецензируемых работ расширят наше представление о применении и ценности этого метагеномного подхода для обнаружения патогенов в моче.

   Применение метагеномики методом дробовика прошло долгий путь при различных инфекциях, описанных выше (менингит/энцефалит, сепсис, пневмония и инфекции мочевыводящих путей). Исследования, использующие этот подход для диагностики инфекций костей, связанных с ними тканей, а также собственных или протезированных суставов, ограничены. Данные для оценки относительной клинической ценности, влияния на клинический исход, чувствительности и специфичности недостаточны.

5. Факторы, которые следует учитывать при внедрении этих технологий

   Что касается внедрения в лаборатории, то в настоящее время не существует утвержденных FDA США тестов для WGS, но многие лаборатории, сертифицированные CLIA, включая лаборатории общественного здравоохранения, имеют валидированные тесты для проведения WGS, включая и биоинформационные рабочие процессы. При принятии решения о том, является ли внедрение этих технологий секвенирования оптимальным для вашей лаборатории, необходимо учитывать множество факторов. Существует несколько отличных обзоров, в которых это обсуждается более подробно, но мы остановимся на нескольких основных факторах, которые мы считаем наиболее важными перед внедрением технологий секвенирования в клиническую микробиологию.

   Первый фактор, который необходимо учитывать, - это процесс валидации лаборатории для этих NGS-приложений (т. е. WGS, целевой метагеномики и метагеномики дробовиком). Процесс валидации лабораторных тестов очень дорог и занимает много времени, что ограничивает круг лабораторий, которые могут использовать этот тип технологии. Параметры, необходимые для валидации лабораторных тестов, могут быть труднодостижимыми для таких приложений NGS. 

   Основные аспекты контроля качества лабораторных тестов для NGS трудно определить, поскольку в сообществе клинических микробиологов нет согласованного референсного стандарта. В случае с WGS легко определить последовательность штамма положительного типа и отрицательного контроля при каждом анализе, чтобы убедиться, что анализ работает правильно. Однако при использовании метагеномных подходов лабораториям придется собирать макет сообщества или пробы с интересующими организмами, и опять же нет согласия по поводу состава этих макетов сообществ. 

   Также трудно найти метод золотого стандарта для точного сравнения с результатами применения NGS, поскольку во многих случаях было показано, что применение NGS превосходит стандартные методы в обнаружении микроорганизмов. Недавно CDC США и Ассоциация лабораторий общественного здравоохранения США (APHL) создали веб-справочник, содержащий инструменты и ресурсы для систем управления качеством, к которым лаборатории могут обратиться при рассмотрении вопроса о валидации этих тестов (https://www.cdc.gov/labquality/qms-tools-and-resources.html). Однако даже при наличии этих инструментов и ресурсов сложность этих NGS-подходов и строгий процесс валидации в настоящее время удерживают эту технологию в пространстве референс-лабораторий и крупных академических медицинских центров.

   Второй фактор, который необходимо учитывать при внедрении этих NGS-технологий, - это представление результатов, особенно в части интерпретации и клинической полезности метагеномных подходов. 

Создание биоинформационных конвейеров для обработки данных о последовательностях требует значительного времени и опыта, причем не только для кодирования и вычислений, но и для микробиологической и клинической интерпретации результатов. 

   В настоящее время не существует коммерциализированных биоинформационных программ для интерпретации данных, однако несколько крупных академических медицинских центров опубликовали свои рабочие процессы для всех трех приложений NGS - WGS, целевого секвенирования и метагеномики методом дробовика. Один из аспектов, который мы поддерживаем и который несколько лабораторий рекомендовали для помощи в интерпретации и представлении результатов этих NGS-приложений, - это создание и использование группы лиц или консультативного совета. Члены группы/совета могли бы быть экспертами, помогающим в интерпретации интересных или неоднозначных результатов, и гарантировать, что сообщаемые результаты соответствуют клинической картине.

   Последний важный фактор, который необходимо учитывать при внедрении этих NGS-подходов в лаборатории клинической микробиологии, - это стоимость. Хотя стоимость секвенирования образца или организма снизилась, затраты на внедрение этой технологии в лаборатории клинической микробиологии очень велики. Одним из первых препятствий, связанных с затратами, является наличие физического пространства для проведения лабораторной части анализа. Важно, чтобы лаборатория была приспособлена для раздельного хранения материалов и помещений до и после амплификации. Это поможет уменьшить возможную контаминацию образцов. Еще одной крупной статьей расходов, о которой уже упоминалось, является валидация тестов. Кроме того, после того как тест будет утвержден и внедрен, его трудно будет включить в лабораторию, чтобы заменить традиционные микробиологические культуры, которые обычно стоят не так дорого.

6. Будущее NGS в клинической микробиологии

   Использование NGS в лаборатории клинической микробиологии уже стало реальностью, но только для немногих лабораторий, имеющих бюджет и персонал, позволяющий это сделать. В этом обзоре мы выдвигаем гипотезы и прогнозируем некоторые из потенциальных будущих направлений развития этой технологии в диагностической микробиологии. Во-первых, процесс секвенирования значительно подешевел с момента появления первого поколения секвенаторов. Можно предположить, что эта технология станет дешевле, что позволит ей быть более доступной для лабораторий, не входящих в состав крупных референс-лабораторий или крупных академических медицинских центров. Мы считаем, что секвенирование может стать недорогим и достаточно быстрым по сравнению с культурально-зависимыми методами. Например, с помощью WGS можно будет идентифицировать колонию, растущую на чашке, и получить АST-профиль этого организма за время, сравнимое с тем, которое требуется для проведения и простой идентификации при обычном микробиологическом исследовании.

   Если рассматривать АST-тестирование, то основным критерием внедрения молекулярного AMR-тестирования в общее микробиологическое обследование является соответствие между фенотипическими и генотипическими результатами AMR. 

Даже если в генотипическом профиле обнаружен маркер гена резистентности к антибиотикам, нет гарантии, что этот ген транслируется и транскрибируется для производства фермента или белка, обеспечивающего резистентность, если это не видно в результатах фенотипической чувствительности. 

   В будущем было бы полезно включить в программу исследования рабочий протокол протеомики, чтобы увидеть, какие белки экспрессируются, что поможет сделать вывод о фенотипических профилях чувствительности к антибиотикам.

   Еще одна область, в которой в ближайшие 5 лет может быть достигнут значительный прогресс, - это биоинформационный анализ, в частности, для секвенирования метагеномов с методом дробовика. Существующие в настоящее время биоинформационные конвейеры для секвенирования методом дробовика позволяют обнаружить множество патогенов, присутствующих в данном образце. Однако современные технологии не позволяют собрать полный геном патогена, если только это не вирус. В будущем можно представить, что биоинформационный конвейер для проведения метагеномики методом дробовика в клиническом образце будет достаточно сложным, чтобы определить истинную сборку полного генома патогена с возможностью прогнозирования маркеров вирулентности и резистентности к противомикробным препаратам.

7. Заключение

   Технологии NGS существуют уже несколько десятилетий, но только начинают менять диагностический потенциал лабораторий клинической микробиологии и здравоохранения. В этих областях WGS позволяет идентифицировать организмы и осуществлять надзор за потенциальными вспышками заболеваний. Кроме того, WGS помогает обнаружить не только известные гены и механизмы антимикробной резистентности, но и новые гены или механизмы, которые на данный момент не определены. Целевое и метагеномное секвенирование непосредственно из образцов помогает увеличить количество обнаруженных организмов, представляющих интерес, особенно тех, для которых обычные методы недостаточно чувствительны или недоступны. Эти технологии NGS меняют облик клинической микробиологической диагностики, какой мы ее знаем. Хотя NGS не может заменить обычные лабораторные исследования в области микробиологии, объем информации, получаемой с помощью секвенирования, только улучшит качество лечения пациентов.

Новости
Микробиомы опухолей предлагают новые идеи для совершенствования терапии рака
#резистентность к противоопухолевым препаратам #противоопухолевая терапия #микроорганизмы раковых опухолей #микробиом опухоли
Микробные сообщества обитают во многих нишах человеческого организма и являются важными модуляторами иммунной системы хозяина и реакции на противораковую терапию.    В недавнем исследовании ученые применили биоинформационный подход для изучения микробиоты при метастатических злокачественных опухолях, изучив 4160 образцов различных видов рака. Авторы использовали метагеномику, геномику, транскриптомику и клинические данные для создания общеракового репозитория, который может помочь в совершенствовании методов лечения. Они применили два различных вычислительных подхода, PathSeq и Kraken2, для определения сообществ микробиома, обитающих в опухолях, на уровне родов и метагеномной сборки на уровне видов. Затем исследователи сформировали микробиомы метастатических опухолей, определив элементы, влияющие на их состав, и оценив микробные сообщества, характерные для конкретного типа рака. Они оценивали степень гипоксии в метастатических раковых опухолях по характерному профилю генов гипоксии, а затем провели анализ обогащения набора генов (GSEA). Они также выяснили, могут ли микробные сообщества влиять на иммунитет хозяина.    Исследователи изучили связь между грамотрицательными бактериями в метастазах и экспрессией Toll-подобных рецепторов (TLR), а также выяснили, играют ли липополисахариды мертвых или активных бактерий, главную роль в сигнализации TLR4 в метастазах. Кроме того, они проанализировали взаимосвязь между составом бактерий и экспрессией опухолевых генов, а также взаимосвязи между конкретными бактериями и иммунными клетками.    Чтобы глубже понять влияние метастатической гетерогенности и устойчивости микроорганизмов, обитающих в опухоли, с течением времени, ученые исследовали 185 пар из 370 повторных образцов опухолей, полученных от 173 разных людей. Они изучили изменения бактериального обогащения до и после начала лечения опухолей с помощью иммунотерапии, таргетной терапии или гормональной терапии. Они также исследовали уменьшение количества бактерий после иммунотерапии у пациентов, отвечающих на лечение, и выяснили, были ли эти микроорганизмы более распространены у людей, не отвечающих на лечение, до начала терапии. Наконец, они изучили бактериальные сообщества до лечения, связанные с отсутствием ответа на иммуносупрессивные препараты в когорте пациентов с немелкоклеточной карциномой легких, получавших монотерапию блокаторами контрольных точек иммунитета.    Исследователи обнаружили ДНК бактерий, обитающих в опухолях, в когорте пациентов с метастазами рака, а сборка бактериальной ДНК, полученной из опухолей, позволила получить геномную характеристику на уровне видов. Бактериальное разнообразие коррелировало с характеристиками клеточного и молекулярного иммунитета опухоли. В когорте больных немелкоклеточной карциномой легких высокие уровни ДНК фузобактерий означали плохой ответ на иммунотерапию. Исследователи обнаружили органоспецифические тропизмы микробов, обогащение анаэробными бактериями гипоксических опухолей, связь между микробным разнообразием и опухоль-инфильтрирующими нейтрофилами, а также связь фузобактерий с устойчивостью к терапии блокаторами контрольных точек иммунитета при раке легких.    Используя методы картирования и отбора родов для исключения технической контаминации и редко встречающихся родов, авторы составили каталог 165 микробных родов из 3 526 образцов, среди которых 68% составляли факультативные/анаэробные и 49% - грамотрицательные анаэробы. Они построили 514 собранных метагенома (MAGs) среднего и почти высокого качества, используя микробные последовательности, полученные из опухолей. Наиболее распространенными типами опухолей были колоректальная, молочная, предстательная, легочная и меланома, а наиболее частыми местами метастазирования опухолевых образцов были лимфатические узлы, печень и легкие.    Количество бактериальных прочтений, выраженное как доля генетических прочтений, сопоставленных с человеческими, варьировало в зависимости от типа рака: более высокая доля наблюдалась при злокачественных опухолях почек и матки, а меньшая - при опухолях, происходящих из головного и спинного мозга. Метастазы почек и колоректальные метастазы были наиболее разнообразны, но в метастатических опухолях головы и шеи преобладали другие виды микроорганизмов.    Обитающие в опухоли микробные сообщества были связаны с биологией опухоли, при этом наблюдалась сильная корреляция между нагрузкой липополисахаридами и уровнем TLR4, но не с нагрузкой грамположительной липотейхоевой кислоты. Многомерное моделирование по методу пропорциональных рисков Кокса показало, что более низкие показатели общей выживаемости и выживаемости без прогрессирования значительно коррелируют с постоянным обилием Fusobacterium, учитывая геномную мутационную нагрузку. Используя массив данных по раку, исследователи классифицировали все опухоли как Fusobacterium - высокие или Fusobacterium - низкие. В опухолях с высоким содержанием Fusobacterium были значительно снижены профили экспрессии генов цитотоксичности, интерферона-гамма (IFN-γ) и основного комплекса гистосовместимости (MHC) класса II.    Исследование представляет собой первую крупномасштабную панраковую карту внутриопухолевых микробиомов в метастатических злокачественных опухолях, позволяющую изучить их разнообразие в зависимости от анатомических регионов, исходного типа опухоли и реакции на лечение, включая иммунотерапию. Исследование показало, что метастатический микробиом частично состоит из анаэробных бактерий, которые могут изменяться в процессе лечения. Анализ данных также обнаружил связь между внутриопухолевыми микроорганизмами и активацией путей врожденного иммунитета, что указывает на изменение микроокружения опухоли путем прямой идентификации бактериальных лигандов. Кроме того, долгосрочный отбор проб опухоли позволил выявить временную эволюцию микробных сообществ и определить бактерии, истощающиеся при блокаде иммунных контрольных точек. В совокупности авторы создали панраковый ресурс микробиома метастатических опухолей, который может способствовать совершенствованию стратегий лечения.
Аннотация
Интеграция исследований бактериальных патогенов и комменсалов для борьбы с инфекциями (аннотация)
#факторы вирулентности #персонализированная терапия #мобильные генетические элементы #горизонтальный перенос генов #экология микроорганизмов #факторы патогенности #условно-патогенные бактерии #стратегии уклонения патогенов от иммунитета #патогены #патогенность #острова патогенности #микробные экосистемы #микробиом #комменсальная микробиота #комменсалы
Все большее признание целостности микробиома человека в качестве требования к здоровью радикально меняет представление о членах бактериального микробиома и их взаимодействии между собой и с хозяином.     Это изменение в понимании ставит принципы микробной экологии в центр инновационных подходов к профилактике и лечению основных заболеваний человека. Микробиомные сигнатуры, полученные в результате анализа метагенома, рассматриваются в качестве биомаркеров для диагностики различных заболеваний, начиная от различных видов рака, таких как рак толстой кишки или молочной железы, и заканчивая аутоиммунными расстройствами, такими как ревматоидный артрит или псориаз. Трансплантация фекальной микробиоты эффективно используется для лечения инфекций, вызванных Clostridioides difficile, а добавление в рацион членов микробиома (например, Akkermansia muciniphila) или продуктов микробиома (например, короткоцепочечных жирных кислот) показало перспективность улучшения состояния здоровья при метаболических и онкологических расстройствах.    Экологические принципы микробной приспособленности, конкуренции и эволюции, установленные в контексте бактериальных сообществ окружающей среды, в настоящее время все чаще применяются к микробиомам, связанным с хозяином. Тем не менее, между экологическими и связанными с человеком микробными экосистемами существуют фундаментальные различия. Многие экологические микробиомы представляют собой обширные, неограниченные экосистемы и часто имеют неограниченный срок жизни, что создает минимальный барьер для распространения микроорганизмов. Напротив, микробиомы, связанные с хозяином, например, в кишечнике человека, представляют собой ограниченные экосистемы с коротким сроком жизни. Микробиомы, ассоциированные с хозяином, требуют специфических бактериальных механизмов для передачи между людьми и поколениями и для временного сохранения вне предпочтительных условий жизни. Кроме того, хозяева подвергают микробных колонизаторов стрессовым воздействиям, отличным от среды обитания, в частности, через иммунную систему слизистых оболочек.    Исторически сложилось так, что исследования микробных экосистем, связанных с хозяином, ограничивались отдельными исследованиями нейтральных или мутуалистических бактерий-комменсалов и вредных патогенов, проводимыми различными исследовательскими группами. Таким образом, современное представление об этих различных группах бактерий, ассоциированных с хозяином, является крайне асимметричным, с сильным уклоном в сторону патогенов, что препятствует всестороннему пониманию экологии микробиома человека. Несмотря на широкое взаимодействие этих групп бактерий в естественной среде обитания, экспериментальные исследования по взаимодействию комменсалов и патогенов малочисленны. Например, типичные патогены встречаются в микробиоме человека как практически одомашненные члены, в то время как комменсалы могут вступать в сговор с патогенами, например, при полимикробных инфекциях.    Хотя традиционное разграничение комменсальных и патогенных микроорганизмов остается важным критерием в инфекционной медицине, в экологическом контексте присущее этим группам микроорганизмов дублирование свойств делает это разграничение неадекватным. Полезный комменсализм и антагонистическая патогенность представляют собой противоположные стороны целого ряда форм поведения бактерий, хотя лишь немногие представители бактериального микробиома могут демонстрировать настоящее патогенное поведение. Многие виды или клоны бактерий могут динамически менять свою способность функционировать как комменсалы или патогены в зависимости от условий окружающей среды и физиологического состояния хозяина, что еще больше усложняет различие. Например, дисбиоз микробиома и иммунные дефекты хозяина могут превратить Enterococcus faecium из практически безобидного члена кишечного микробиома в причину инфекций кровотока. Более того, одно событие горизонтального переноса генов может изменить баланс между комменсальным и патогенным образом жизни, например, когда токсин, кодируемый профагом, становится основным фактором вирулентности энтерогеморрагической кишечной палочки или Corynebacterium diphtheriae, заселяющей кожу и ротоглотку.    Динамические изменения между комменсализмом и патогенностью у факультативных бактериальных патогенов ставят под сомнение текущее, часто непоследовательное использование термина "инфекция". Мы предлагаем оставить термин "инфекция" для обозначения патологических состояний, вызванных появлением бактериального штамма в определенной ткани органа. К таким состояниям можно отнести, например, возникновение диареи в толстой кишке в результате попадания Shigella flexneri из пищи или воды, абсцессов в коже в результате попадания Staphylococcus aureus или пневмонии в легких в результате попадания Streptococcus pneumoniae. Поэтому в данном обзоре мы называем бактерии, которые регулярно вызывают инфекции, патогенами, а те, которые не вызывают, - комменсалами, хотя признаем, что эти термины имеют свои ограничения и не описывают все типы антагонизмов между микробами и хозяевами должным образом. Размытое различие между патогенами и комменсалами также ставит под сомнение постулаты Коха, которые предполагают монокаузальную связь между конкретным микроорганизмом и соответствующим заболеванием. Однако в действительности некоторые заболевания возникают в результате косвенного воздействия нескольких видов бактерий, когда дисбаланс микробиома, а не просто присутствие таких видов вызывает специфическое патологическое состояние, которое не рассматривается как типичная инфекция.    Стремительный прогресс в области изучения микробиома и новые технологии заложили основу для нового этапа развития микробиологии, который объединяет исследования бактериальных патогенов и комменсалов, выходя за рамки редукционистских подходов. Чтобы изучить, как изменения в окружающей среде влияют на динамические изменения поведения членов бактериального микробиома, микробиологи разного профиля должны сотрудничать и объединять свой опыт в таких взаимодополняющих дисциплинах, как системная биология, химия натуральных продуктов, иммунология слизистых оболочек и клинические инфекционные заболевания.     Эти новые подходы могут помочь ответить на некоторые из наиболее актуальных и очевидных вопросов:     - Почему лишь некоторые бактерии, связанные с хозяином, используют значительную часть своей генетической информации для манипулирования клетками хозяина и нанесения им вреда?     - Каковы экологические преимущества экспрессии факторов вирулентности у таких "профессиональных" патогенов?     - Почему некоторые комменсалы превращаются в случайных патогенов, вызывающих заболевания при нарушении состава микробиома или ослаблении иммунной защиты хозяина?     - Как можно использовать современные знания об экологических принципах для разработки эффективных методов профилактики и лечения инфекций, особенно вызванных антибиотикорезистентными и трудно поддающимися лечению патогенами?     - Можно ли оптимизировать микробиом, чтобы способствовать развитию полезных для здоровья пробиотических бактерий или специально обезвреживать патогены, позволяя при этом комменсалам оставаться невредимыми?    В следующем разделе мы рассмотрим направления исследований, посвященных механизмам выживания комменсальных и патогенных бактерий. Будущие исследования комменсальных бактерий, вдохновленные исследованиями патогенов    Благодаря высокой клинической значимости и сравнительной простоте культивирования и манипуляций, основные бактериальные патогены, такие как S.flexneri, S.aureus и S.pneumoniae, изучаются уже несколько десятилетий и в гораздо большей степени, чем типичные комменсалы, ассоциированные с хозяином. В отличие от этого, основные комменсалы, ассоциированные с человеком, например, представители родов Bacteroides, Clostridium и Cutibacterium, исследовались лишь в нескольких лабораториях. Действительно, большинство представителей микробиома человека по-прежнему сложно культивировать и они не поддаются генетическому изучению. Некоторые из комменсалов, которые при определенных обстоятельствах могут стать случайными патогенами, например нозокомиальные клоны E.coli, E.faecium или Staphylococcus epidermidis, в определенной степени изучены, но почему именно эти бактерии вызывают инвазивные инфекции чаще, чем другие, более безобидные комменсалы, остается неясным.    Все больше данных свидетельствуют о том, что некоторые комменсальные бактерии важны для здоровья человека. Например, вырабатывая специфические антибактериальные соединения, комменсальные клоны Blautia producta подавляют и исключают E.faecium, а клоны Staphylococcus lugdunensis подавляют и исключают S.aureus. Кишечная Bacillus subtilis выделяет ингибирующее соединение, которое блокирует способность S.aureus к колонизации или экспрессию факторов вирулентности у Enterococcus faecalis. Некоторые комменсалы также могут вырабатывать соединения, оказывающие прямое благоприятное воздействие на организм хозяина, способствуя, например, успешному лечению опухолей. Изучение патогенов может помочь понять биологию таких полезных комменсалов и использовать их против бактериальных инфекций. Многие важные свойства комменсалов могут варьировать среди отдельных штаммов, например, в зависимости от приобретения или потери мобильных генетических элементов, таких как геномные острова, кодирующие устойчивость или признаки жизнеспособности.    Существующие подходы к классификации патогенов по клонам, такие как схемы типирования последовательностей, могут быть применены и к комменсалам. Эти подходы могут помочь повысить эффективность текущих диагностических стратегий до нового уровня персонализированной инфекционной медицины, отслеживая не только наличие конкретных опасных патогенов, но и отсутствие конкретных полезных комменсалов, например, защищающих от колонизации потенциальными патогенами.    Как и большинство основных бактериальных патогенов, многие комменсалы также специфичны для определенных видов хозяев. Процессы адаптации, приводящие к специфичности хозяина, возможно, служат стратегией повышения приспособленности бактерий в конкуренции с другими, менее приспособленными микроорганизмами. Механизмы, лежащие в основе этого процесса, мало изучены для патогенов и практически неясны для апатогенных комменсалов. Продолжение колонизации конкретного хозяина часто зависит от эффективной адгезии к эпителиальным связывающим структурам, таким как поверхностные белки, протеогликаны или гликолипиды. Хотя соответствующие бактериальные адгезины были в той или иной степени изучены у многих основных патогенов, подобные механизмы у комменсальных микробов изучаются только сейчас.    Выживание бактерий на эпителиальных поверхностях ограничивается механизмами защиты слизистой оболочки хозяина, включая выработку IgA, антимикробных пептидов и липидов, а также реактивных соединений кислорода и азота. Механизмы врожденного и адаптивного иммунитета, запускаемые при обнаружении молекул микроб-ассоциированного молекулярного паттерна или выявлении микробных антигенов лейкоцитами слизистой оболочки, способствуют процессам мукозального иммунитета, приводя к высвобождению провоспалительных или противовоспалительных сигнальных и эффекторных молекул. Продолжение колонизации хозяина зависит от способности бактерий либо переносить антимикробные иммунные эффекторы, либо снижать их экспрессию, вызывая иммунологическую толерантность.    Бактерии с повышенной толерантностью к антимикробным эффекторам хозяина могут даже вызывать и использовать антимикробные реакции хозяина для уничтожения более восприимчивых конкурентов. Антагонистическое взаимодействие с другими членами микробиома, зависящее от иммунных реакций хозяина, было зафиксировано для S.epidermidis и Salmonella enterica Typhimurium. Обширные исследования пролили свет на механизмы иммунной агрессии основных патогенов, но используют ли комменсалы аналогичные или иные стратегии, остается неизвестным.    Например, некоторые кишечные комменсалы притупляют врожденные иммунные реакции, вырабатывая невоспалительные белки флагеллины, которые глушат человеческий Toll-подобный рецептор 5, или короткоцепочечные жирные кислоты, которые могут индуцировать регуляторные Т-клетки на поверхности слизистой оболочки, что способствует иммунотолерантности. Однако основные механизмы контроля могут быть нарушены и привести к заболеваниям в ситуациях, когда хозяин не в состоянии инициировать толерантность и отвечает воспалением, например, при эктопическом заселении кишечника комменсалами.    В целом, взаимодействие бактерий в экосистемах, связанных с хозяином, в значительной степени зависит от секретируемых факторов, которые могут выделяться либо в виде отдельных растворимых молекул через специализированные системы секреции, либо в виде компонентов мембранных везикул. По этой причине секретируемые факторы вирулентности бактериальных патогенов интенсивно изучаются. В отличие от этого, вопрос о том, как секретируемые первичные или вторичные метаболиты или белковые медиаторы комменсалов модулируют взаимодействие с патогенами и хозяином, изучен лишь в нескольких работах. Эти исследования показали, например, как некоторые комменсалы выделяют молекулы, такие как бактериоцины, которые уничтожают патогены, такие как S.aureus или генерируют питательные вещества, способствующие размножению патогенов, таких как C.difficile. Таким образом, выявляется новый уровень сложности в микробных экосистемах, связанных с хозяином. Расширение знаний о механизмах приспособления факультативных патогенов человека    Многие основные бактериальные патогены человека не являются облигатными патогенами, а колонизируют поверхности тела человека или животных в качестве обычных членов микробиома, не вызывая заболеваний. Действительно, острые инфекции являются редкими эпизодами в основном комменсальном образе жизни большинства этих факультативных патогенов. Однако исследования в основном сосредоточены на механизмах вирулентности таких патогенов, как S.flexneri, S.aureus и S.pneumoniae, а механизмы, определяющие приспособленность этих организмов к конкуренции с другими членами микробиома во время комменсального поведения, остаются без внимания.    Остается неясным, являются ли и какие типы инфекций действительно выгодными для бактерий или их следует рассматривать как случайные события, не приносящие пользы для их долгосрочного эволюционного успеха в течение нескольких поколений хозяев, с точки зрения микробов. Более глубокое понимание бактериальных инфекций сегодня важно как никогда, учитывая растущее глобальное бремя резистентности к противомикробным препаратам и бактериальных инфекций.    Современные знания о бактериальных инфекциях ограничены несколькими модельными патогенами, такими как S.aureus и S.pneumoniae. Напротив, некоторые из известных антибиотикорезистентных видов бактерий, названные патогенами ESKAPE в соответствии с первыми буквами родовых названий следующих видов патогенов: E.faecium, S.aureus, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa и Enterobacter cloacae, изучены гораздо менее подробно. Механизмы антибиотикорезистентности обычно представляют собой бремя приспособленности в отсутствие давления отбора антибиотиков, но некоторые из патогенов ESKAPE развили черты резистентности, которые сохраняются даже за пределами медицинских учреждений. Компенсаторные мутации, преодолевающие бремя резистентности, могут способствовать успеху резистентных клонов и распространению резистентности. Почему метициллин-резистентные S.aureus или ванкомицин-резистентные E.faecium так эффективно распространяются и расширяются за счет своих чувствительных к антибиотикам собратьев, остается загадкой.    Экологические концепции широко распространены в области общей и экологической микробиологии, но не нашли широкого применения в понимании патогенных бактерий. Успех бактериального клона в конкуренции с другими членами микробиома зависит от различных механизмов, включая способность использовать питательные вещества, ограничивающие рост, получать выгоду от стимулирующих рост общих ресурсов, таких как полимер-гидролитические ферменты или металлофоры, поглощающие следовые металлы, от других бактерий, противостоять антимикробным молекулам, выделяемым членами микробного сообщества, или адгезировать к нескольким местам прикрепления к эпителию.    Долгосрочный экологический успех бактериального вида или клона обусловлен совокупным эффектом распространения вида в конкретном организме-хозяине и распространением вида на новые организмы-хозяева. Для изучения распространения вида в конкретном организме-хозяине необходимо использовать ряд стратегий исследования взаимных или антагонистических взаимодействий, от изучения комменсалов до изучения основных профессиональных и случайных патогенов. Чтобы изучить распространение вида на новые организмы-хозяева, необходимо исследовать процессы передачи в новые организмы-хозяева с помощью инновационных экспериментальных подходов.     Бактерии, колонизирующие или инфицирующие человека или животных, могут использовать две различные стратегии - вертикальную передачу (от родителей к потомству) или латеральную передачу (через социальные взаимодействия) новым организмам-хозяевам. Механизмы, лежащие в основе этих способов передачи, до сих пор в значительной степени игнорировались как у комменсалов, так и у патогенов. Вертикальная передача способствует адаптации микроорганизмов к хозяину и обычно используется комменсалами, в то время как латеральная передача характерна для многих патогенов. Однако развитие индивидуальных микробиомов может опираться на обе стратегии, причем обе стратегии по-разному способствуют передаче различных видов бактерий. Действительно, одно исследование 2022 года показало, что члены бактериального микробиома различаются по своей склонности к вертикальному или латеральному распространению.    Например, модели латерального распространения клонов эпидемических патогенов были подробно изучены для Helicobacter pylori, S.pneumoniae и S.aureus. Хотя эти закономерности часто хорошо документируются программами общественного мониторинга, механизмы, управляющие выживанием вне организмов хозяев и вторжением в микробиомы новых хозяев, остаются во многом неясными. Соответственно, неизвестно, почему некоторые члены бактериального микробиома распространяются медленно и преимущественно в вертикальном направлении, а другие быстро распространяются от человека к человеку, даже в больших человеческих популяциях.    Эпидемическое распространение основных патогенов, вероятно, связано с типами и тяжестью инфекций, которые эти патогены вызывают. Вклад характеристик заболевания в распространение бактерий наиболее очевиден для возбудителей диареи, таких как S.flexneri, которые получают выгоду от распространения через загрязненные сточные воды. Другие распространенные проявления инфекций могут служить аналогичным целям. Типичные инфекции, вызываемые S.aureus, - гнойные инфекции кожи и ран - приводят к появлению огромного количества клеток S.aureus на поверхности тела, что способствует распространению от хозяина к хозяину через кожные контакты. Аналогичные механизмы могут обеспечивать быстрое распространение от хозяина к хозяину таких урогенитальных патогенов, как Neisseria gonorrhoeae.    Возбудители инфекций дыхательных путей - Bordetella pertussis, Streptococcus pyogenes или S.pneumoniae - распространяются через аэрозоли, выделяемые кашляющими или чихающими людьми. Вопрос о том, способствует ли тяжесть заболевания распространению патогена и каким образом, обсуждался, например, в контексте SARS-CoV-2, но пока не проводилась систематическая оценка бактериальных патогенов.     Примечательно, что большинство профессиональных бактериальных патогенов не являются основными членами микробиома человека и колонизируют человека лишь транзиторно, что требует от них наличия эффективных механизмов латерального распространения. Продолжительная колонизация профессиональными патогенами человека (например, S.flexneri и N.gonorrhoeae) встречается редко или только в небольшой части человеческой популяции (например, для S.aureus) или в определенных возрастных группах (например, для S.pyogenes или S.pneumoniae), что говорит о том, что поддержание обширного арсенала вирулентности связано с существенным бременем поддержания жизнеспособности в условиях конкуренции с другими членами микробиома.    Случайные патогены, такие как E.faecium и S.epidermidis, экспрессируют факторы, способствующие их иммуноуничтожению, но почти не содержат агрессивных токсинов, что может способствовать тому, что эти патогены имеют более высокую распространенность и персистенцию в микробиоме человека, чем большинство профессиональных патогенов. Поскольку случайные патогены вызывают инфекции преимущественно у лиц с ослабленным иммунитетом, случайные патогены также часто называют условно-патогенными. Однако этот термин также часто используется в отношении профессиональных патогенов, таких как S.aureus и S.pneumoniae, которые вызывают другие и более тяжелые типы инфекций (обычно инфекции кровотока) у людей с ослабленным иммунитетом, чем у иммунокомпетентных людей. Соответственно, профессиональные патогены также могут иногда вызывать случайные инфекции, которые не способствуют распространению патогена. Случайные инфекции человека могут быть вызваны такими патогенами, как Legionella pneumophila или Vibrio cholerae, которые адаптированы к нечеловеческим хозяевам и заражают человека только при определенных условиях окружающей среды. Интегративное понимание жизнеспособности бактериальных комменсалов и патогенов может помочь в профилактике инфекций    Совместное изучение комменсалов и патогенов в их естественном контексте может помочь найти лучшие способы контроля над микробами и борьбы с инфекциями и другими заболеваниями, связанными с микробиомом. Комменсальные бактерии, по-видимому, оказывают гораздо более сложное влияние на инфекционные заболевания, чем предполагалось ранее. Некоторые комменсальные виды используют стратегии активной защиты, такие как выделение антимикробных бактериоцинов или уничтожение других бактерий с помощью контактно-зависимых систем секреции типа-V, типа-VI или типа-VII, которые могут сильно отличаться по своей специфичности для определенных видов-мишеней.    Более того, комменсалы могут использовать более тонкие ингибирующие стратегии для повышения своего экологического успеха в борьбе с колонизацией патогенами, основанные на метаболическом вмешательстве. Сообщества комменсальных бактерий могут блокировать доступ патогенов, таких как K.pneumoniae и S.Typhimurium, к питательным веществам совместными усилиями, которые зависят от разнообразия сообщества и его метаболического перекрытия с патогеном.    В качестве альтернативы, исключение патогенов может быть результатом секвестрации основных микроэлементов выделяемыми комменсалами металлофорами или выработкой ингибирующих метаболитов. Например, некоторые комменсалы кишечника могут преобразовывать первичные желчные кислоты во вторичные метаболиты желчных кислот, которые подавляют рост спор кишечного патогена C.difficile.    Восстановление микробиома путем трансплантации фекального микробиома - эффективная стратегия лечения инфекции C.difficile. Успех трансплантации фекального микробиома, по крайней мере, частично объясняется восстановлением сообщества полезных бактерий и их метаболитов, которые подавляют рост C.difficile. Однако транпланацию фекального микробиома трудно стандартизировать, и ее ценность в сравнении с другими патогенами остается неясной.    Использование определенных комменсальных клонов или сообществ для подходов к редактированию микробиома может дать более последовательные результаты и позволить применять персонализированные стратегии, адаптированные к конкретному составу микробиома. В настоящее время проводятся доклинические и клинические испытания по оценке использования комменсальных терапевтических продуктов для предотвращения колонизации антибиотикорезистентными патогенами у людей из группы риска.    Однако те же самые комменсалы, которые защищают от колонизации патогенами, зачастую более чувствительны к антибиотикам, чем патогены-мишени, что может свести на нет благотворное влияние комменсалов и способствовать развитию заболеваний, связанных с дисбиозом, во время антибиотикотерапии. Систематическая оценка чувствительности к антибиотикам важнейших групп комменсалов и включение этих знаний в персонализированные, основанные на микробиоме схемы управления антибиотиками необходимы для минимизации побочного ущерба микробиому от применения антибиотиков широкого спектра действия. Помимо обычных антибиотиков, многие кишечные комменсалы могут быть подавлены множеством неантибиотических препаратов, направленных на человека. Такие неожиданные побочные эффекты лекарств необходимо учитывать в будущем, особенно у мультиморбидных людей, нуждающихся в полифармации.    Выяснилось, что микробиом сам по себе является богатым источником новых классов антимикробных препаратов с необычными свойствами и способами действия. Систематическая идентификация и характеристика таких инновационных соединений может стать перспективной стратегией для открытия новых агентов, которые предотвращают или устраняют колонизацию патогенов. В клинической практике стратегии антибиотикотерапии в основном опираются на антибиотики широкого спектра действия, которые оказывают мощное давление отбора не только на патогены, но и на большинство комменсалов. Следовательно, комменсалы играют решающую роль в эволюции механизмов резистентности и в передаче генов резистентности патогенам.    Межвидовой горизонтальный перенос генов резистентности часто происходит во время антибиотикотерапии, например, через конъюгативные плазмиды широкого спектра действия и трансдуцирующие фаги, даже внутри конкретных организмов-хозяев. Экологический дисбаланс, поддерживающий совместное размножение одних членов за счет других в микробиоме кишечника, может повысить эффективность передачи плазмид за счет увеличения частоты контактов доноров и реципиентов плазмид. Поэтому системы общественного надзора должны быть сосредоточены на эволюции и распространении не только резистентных клонов основных патогенов, но и ключевых видов комменсалов, если комменсалы были идентифицированы как основные переносчики резистентности.    Внедрение экологических концепций в исследования инфекций позволит сделать важные шаги на пути к выявлению "ахиллесовых пят" типичных патогенов. Затем эти патогены могут стать мишенями для интеллектуальных препаратов, которые сделают патогены более чувствительными к антагонистическим механизмам полезных комменсалов или эффекторов защиты хозяина. Такие мишени не могут быть найдены в рамках скрининговых программ, основанных на выращивании патогенов in vitro. Для их идентификации требуется культивирование в соответствующих модельных сообществах, которые еще предстоит создать. Поскольку мышиные модели зачастую малопригодны для изучения патогенов, специфичных только для человека, должны быть созданы контролируемые модели, которые могут открыть новые возможности, например, для профилактики шигеллеза.    Понимание экологической пользы вирулентности будет иметь решающее значение для выявления факторов вирулентности, которые важны для распространения профессиональных патогенов от хозяина к хозяину. Нацеливание на такие механизмы вирулентности с помощью антивирулентных соединений, которые еще предстоит разработать, может помочь ограничить контагиозность и эпидемическое распространение патогенов.    Мукозальный иммунитет играет решающую роль в нейтрализации патогенов и толерантности к комменсалам. Вопрос о том, влияет ли инвазивность членов микробиома на активацию врожденных и адаптивных механизмов защиты хозяина, включая регуляторные Т-клетки и иммуноглобулины, и как это происходит, только начинает выясняться. Кроме того, до конца не изучена индукция специфических IgA на поверхности слизистых оболочек, и вопрос о том, способствует ли IgA колонизации IgA-связанными бактериями или препятствует ей, также остается во многом неясным. В зависимости от конкретного антигена и вида бактерий IgA может играть противоположную роль.    Хотя многие перспективные поверхностные антигены патогенов были идентифицированы, антигены большинства комменсалов остаются практически неизвестными. Однако комменсалы и патогены иногда имеют общие ключевые поверхностные антигены, что может создать проблемы для разработки эффективных вакцин против бактериальных патогенов, преодолевающих иммунологическую толерантность. Знание антигенных эпитопов патогенных и комменсальных микроорганизмов может помочь в разработке мукозальных вакцин для профилактических и терапевтических подходов против потенциально патогенных членов микробиома. В настоящее время не существует вакцин против большинства патогенов ESKAPE. Это требует разработки новых подходов к борьбе с патогенами, основанных на привлечении комменсалов и иммунных реакциях, обусловленных экологией.
События
Картинка 1
Всероссийский образовательный проект «Клинические рекомендации по антибактериальной терапии внебольничных инфекций: на что обратить внимание практическому врачу?».
#антибактериальная терапия #внебольничные инфекции #клинические рекомендации
Картинка 1
Всероссийский образовательный проект «Клинические рекомендации по антибактериальной терапии внебольничных инфекций: на что обратить внимание практическому врачу?».
Картинка 1
II Северо-западная конференция МАКМАХ по антимикробной терапии и клинической микробиологии
#конференции #клиническая микробиология #антимикробная терапия
Картинка 1
Школа-конференция «Сложные и нерешенные вопросы диагностики, лечения и профилактики ОРЗ, гриппа, хронических вирусных гепатитов и нейроинфекций».
#орз #хронический гепатит #нейроинфекция #инфекционные заболевания #диагностика инфекционных заболеваний #грипп #вирусные гепатиты
Каталог
Библиотека
Узнайте о новостях и событиях микробиологии
Первыми получайте новости и информацию о событиях
up