Новости

Принцип физического расширения биологических образцов для визуализации известен как экспансивная микроскопия.     В этом методе для гомогенного расширения клеток и разуплотнения биомолекул используется гидрогель, что дает исследователям возможность визуализировать мелкие детали с помощью стандартных микроскопов вместо дорогостоящих специализированных инструментов. Лаборатория биофотоники в Университете Карнеги-Меллон, возглавляемая Леоном Чжао, является лидером в области развития экспансивной микроскопии для биомедицинских применений. MicroMagnify, последний протокол, опубликованный лабораторией Чжао, делает еще один шаг вперед в их работе. Этот протокол позволяет расширять сложные микробные клетки и инфицированные ткани без искажений, что обеспечивает улучшенную высокоразрешающую флуоресцентную визуализацию.    Инструменты оптической визуализации со сверхразрешением крайне важны в микробиологии для понимания сложных структур и поведения микроорганизмов, таких как бактерии, грибы и вирусы. "Визуализация инфицированных тканей и патогенных микроорганизмов всегда была сложной задачей из-за мизерного размера бактериальных клеток, зачастую составляющего 1 микрон и менее", - пояснил Чжао. "Разработка экономически эффективной наноразмерной технологии визуализации патогенов в тканях хозяина крайне важна как для научных исследований, так и для клинических применений".    Традиционные методы экспансии с трудом позволяют разрушить толстые, жесткие клеточные стенки бактериальных патогенов, таких как золотистый стафилококк, и аналогичные оболочки грибковых патогенов, которые обеспечивают сохранность формы клеток. Однако сотрудник лаборатории Чжанъю Ченг обнаружил, что сочетание тепловой денатурации и ферментных коктейлей эффективно разрушает клеточные стенки обоих типов и расширяет микробные клетки и инфицированные ткани без деформации. При этом сохраняются различные биомолекулы, а после расширения возможно окрашивание для визуализации. Ченг является первым автором статьи, описывающей этот процесс, и опубликованной в журнале Advanced Science.    Исследователи часто используют флуоресцентные белки для отслеживания молекул и клеток в процессе визуализации, однако существующие протоколы ограничивают возможности приборов не более чем пятью целями за один прием. По словам Чжао, с помощью MicroMagnify они продемонстрировали, что один образец может быть использован для получения изображений 10-12 целей в инфицированной патогеном клетке млекопитающего. "MicroMagnify сохраняет биомолекулы и белки в геле, что позволяет проводить цикл визуализации, маркировки и промывки с использованием различных реагентов каждый раз. Теоретически это позволяет изучать сотни мишеней", - добавил Чжао.    Для лучшего понимания сложных трехмерных изображений, получаемых с помощью MicroMagnify, лаборатория Чжао и Исследовательский институт Бенаройя (BRI) совместно разработали ExMicroVR - среду виртуальной реальности с погружением.  Имея недорогую гарнитуру виртуальной реальности, компьютер с GPU-ускорением и доступ в Интернет, ученые могут виртуально встречаться для изучения биологических данных.    "В этом пространстве участники могут видеть изображение клетки и взаимодействовать с аватарами друг друга", - рассказал Чжао. "Они могут манипулировать изображением клетки, указывать на нее, разговаривать, находить интересующие их области и участвовать в обсуждении реакции клетки на вторжение патогена". Кроме того, MicroMagnify применяется для изучения микробиомов кишечника. "Микробиомы невероятно сложны, и их взаимодействие с органами хозяина может существенно влиять на развитие заболеваний, например, опухолей", - отметил Чжао. "С помощью методов MicroMagnify мы сможем определить состав и сигналы этих микробиомов и изучить, как их взаимодействие с органами хозяина влияет на развитие заболеваний, например, рака. Это позволит нам с наноразмерной точностью составить профиль микробиомов и их сигнальных белков и выявить конкретные популяции, которые могут способствовать прогрессированию заболевания или, наоборот, помочь предотвратить его".

Согласно результатам нового исследования, опубликованным в журнале Pediatrics, для определения инфекций мочевыводящих путей (ИМП) у лихорадящих детей, подвергающихся катетеризации мочевого пузыря, надо ввести новый стандарт порогового значения.    По словам Надера Шайха, профессора педиатрии, клинических и трансляционных наук Медицинской школы Питтсбургского университета, до настоящего времени ни в одном исследовании не проводилось сравнения культуры мочи с независимым от культуры эталонным стандартом, однако в существующих рекомендациях поддерживается значение 50 000 колониеобразующих единиц (КОЕ)/мл.    "Последние 7 лет или около того мы придерживались определения ИМП, которое было основано на предположениях", - сообщил Шайх. "Мы хотели взглянуть на используемый критерий с более научной точки зрения, чтобы выяснить, что является наилучшим вариантом порогового значения. ... Это первое исследование, в котором мы сравниваем [это предположение] с другим стандартом, чтобы лучше понять, как правильно диагностировать инфекции мочевыводящих путей".    В своем исследовании Шайх и его коллеги оценивали диагностические свойства обычного посева мочи при пороговых значениях 10 000 КОЕ/мл, стандартных 50 000 КОЕ/мл и 100 000 КОЕ/мл для выявления случаев ИМП с использованием секвенирования 16S рибосомальной РНК (рРНК) в качестве референсного метода. Исследователи считали, что у участника имеется ИМП, если не менее 80% последовательностей принадлежали к одному таксону и если в моче были обнаружены признаки воспалительной реакции хозяина. В исследование был включен 341 ребенок в возрасте до 3 лет (74% девочек; 40% в возрасте от 2 до 11 месяцев; 67% белых), которым была проведена катетеризация мочевого пузыря, из них у 64% была зафиксирована температура не менее 39°С. Среди этих детей было 46 подтвержденных ИМП.    Использование порогового значения 10 000 КОЕ/мл позволило выявить 45 из 46 случаев ИМП. По мнению исследователей, порог, равный 50 000 КОЕ/мл, показал чувствительность всего 80%, выявив только 37 случаев, и оказал "незначительное влияние" на специфичность по сравнению с более низким пороговым значением. При использовании порогового значения 100 000 КОЕ/мл чувствительность снизилась еще больше - до 70%, но при этом специфичность оказалась аналогичной. "Данное исследование диагностической точности подтверждает использование порогового значения в 10 000 КОЕ/мл для диагностики ИМП у лихорадящих детей, которым проводится катетеризация мочевого пузыря", - сообщил Шайх. По его мнению, дополнительную озабоченность вызывает "чрезмерное использование антибиотиков", связанное с ИМП.    "В данном случае использование более низкого порогового значения не привело к снижению специфичности культурального анализа мочи", - сказал Шайх. "Если мы снизим пороговое значение, мы не будем диагностировать больше детей без инфекции мочевыводящих путей. Это не приведет к нецелесообразному использованию антибиотиков". "Это исследование показало нам, что мы уже давно недодиагностируем ИМП", - сказал он.    Исследование сопровождалось редакционной статьей, авторами которой являются Йенс К. Эйкхофф и Эллен Р. Уолд, оба из Школы медицины и общественного здравоохранения Университета Висконсин-Мэдисон. "Одно из преимуществ 16S-секвенирования по сравнению с обычным культивированием заключается в том, что оно может указать на присутствие организмов, которые трудно культивировать обычным способом", - пишут Эйкхофф и Уолд. "Кроме того, в будущем обещают быстрые сроки выполнения 16S-секвенирования и возможность определения наличия антибиотикорезистентных организмов. Этот метод может дать более полное представление о микроорганизмах в моче, чем это возможно при использовании культуры".    В будущем задача будет заключаться не только в том, чтобы определить, что именно содержится в моче, но и "судить о том, отражает ли это инфекцию или контаминацию", - добавляют авторы."Результаты данного исследования подтверждают эффективность современных методов культивирования, делают шаг вперед, помогая выявить важные симптоматические ИМП, которые могут протекать с низким количеством колоний (порог в 10 000 КОЕ/мл является разумным), но с признаками воспаления в моче, и подтверждают необходимость дальнейшего изучения секвенирования 16S рРНК в качестве диагностического средства при ИМП", - пишут Эйкхофф и Вальд.