Новости

Pseudomonas aeruginosa - грамотрицательная условно-патогенная бактерия, вызывающая различные острые и хронические инфекции у людей.     Из-за роста заболеваемости, сложности лечения и высокой смертности P. aeruginosa является серьезной проблемой и объектом клинического лечения. Обладая относительно большим бактериальным геномом, P. aeruginosa хорошо переносит и адаптируется к различным условиям окружающей среды и имеет естественную резистентность к различным антибиотикам, среди которых трудно поддающаяся лечению резистентная P. aeruginosa (DTR-PA) срочно нуждается в исследовании и разработке новых антибиотиков для борьбы с оппортунистическими инфекциями, вызванными DTR-PA.    Быстрое обнаружение и выяснение механизмов резистентности необходимы для своевременного лечения антибиотиками и мониторинга P. aeruginosa с множественной лекарственной резистентностью (MDR). В настоящее время секвенирование всего генома (WGS) стало передовым методом выявления антимикробной резистентности (AMR), однако клиническое применение WGS ограничено высокой стоимостью, высокими требованиями к образцам и техническими трудностями анализа. Применение анализа на чувствительность к антибиотикам (AST) для диагностики резистентных к противомикробным препаратам патогенов и их антибиограммы требует много времени, громоздких операций и имеет низкий процент положительных результатов, что не может удовлетворить клинические потребности.    Недавно технология метагеномного секвенирования следующего поколения (mNGS) позволила идентифицировать патогены и AMR-ассоциированные гены непосредственно из клинических образцов благодаря своей способности быстро диагностировать невыясненные инфекции. Таким образом, учитывая сложные механизмы резистентности и высокую распространенность вариантозависимой резистентности DTR-PA, возможно предсказать фенотипы резистентности DTR-PA путем выявления AMR-ассоциированных генов с помощью mNGS. Hu и Zhao (2023) сообщили, что среднее время получения результатов AST на основе NGS для клинических образцов составило 19,1 часов, что значительно сократило время получения результатов традиционной технологии определения чувствительности к лекарственным препаратам.    Методы: В этом исследовании данные полногеномного секвенирования (WGS) 494 изолятов P. aeruginosa были использованы для скрининга ключевых генов, связанных с антимикробной резистентностью (AMR) и резистентностью к имипенему (IPM), меропенему (MEM), пиперациллину/тазобактаму (TZP) и левофлоксацину (LVFX) у P. aeruginosa путем сравнения генов с разницей в количестве копий между резистентными и чувствительными штаммами. Затем для прямого прогнозирования резистентности P. aeruginosa к четырем антибиотикам по выявленным AMR-ассоциированным признакам мы собрали 74 положительных образца мокроты P. aeruginosa для секвенирования методом метагеномики следующего поколения (mNGS), из которых 1 образец с низким качеством был исключен. Затем мы построили модель прогнозирования резистентности.    Результаты: Мы выявили 93, 88, 80, 140 AMR-ассоциированных признаков для устойчивости к IPM, MEM, TZP и LVFX у P. aeruginosa. Относительная распространенность AMR-ассоциированных генов была получена путем сопоставления данных mNGS и WGS. 20 лучших признаков со степенью важности для резистентности к IPM, MEM, TZP и LVFX были соответственно использованы для моделирования. Затем мы использовали алгоритм машинного обучения "случайного леса" для построения моделей прогнозирования резистентности P. aeruginosa, при этом площади под кривыми моделей прогнозирования резистентности IPM, MEM, TZP и LVFX были больше 0,8, что свидетельствует о хорошей эффективности этих моделей прогнозирования резистентности.    Выводы: В целом, mNGS может предсказывать резистентность P. aeruginosa путем прямого обнаружения AMR-ассоциированных генов, что дает возможность быстрого клинического выявления лекарственной резистентности патогенных бактерий.

Человеческий организм кишит триллионами бактерий, некоторые из которых поддерживают здоровье, а другие провоцируют заболевания.    Эти различия часто сводятся к генам в каждом бактериальном геноме, но поиск и секвенирование редких штаммов может оказаться непростой задачей. Ганг Фанг, генетик из Медицинской школы Икан, предложил новый метод секвенирования под названием mEnrich-seq, который опирается на результаты его десятилетних исследований бактериальной эпигеномики и позволяет различать ДНК разных видов для метагеномных исследований. В интервью изданию The Scientist Фанг рассказывает о своем видении того, как mEnrich-seq может помочь ученым ответить на сложные вопросы о бактериальных спутниках человека.Какие проблемы связаны с изучением микробиома человека с помощью метагеномики?   У нас есть множество технологий для изучения микробиома разными способами, но есть общая проблема. Если в образце много видов бактерий, то мы можем узнать о них практически все, но если численность вида очень низкая, то изучать его очень сложно. Могут даже существовать два или три сосуществующих штамма одного вида, и важным может быть не тот штамм, который относительно более многочисленный. Эти разные штаммы часто очень похожи по своим геномам, поэтому их крайне сложно отличить друг от друга.Что побудило вас разработать mEnrich-seq?   Если цель является малочисленной, большая часть объема секвенирования будет расходоваться на более распространенные виды. В тот момент, когда мы проводим секвенирование, мы уже проиграли эту битву, поэтому нам нужна новая стратегия перед секвенированием. Естественные эпигенетические штрих-коды бактерий дают нам уникальный способ решить эту проблему. Даже если разные виды и штаммы имеют схожие геномы, они часто кодируют разные ДНК-метилтрансферазы, которые определяют характер метилирования их ДНК. Бактерии делают это, чтобы различать собственную и чужую ДНК. Мы можем использовать это для различения геномов разных видов или штаммов на основе глобального паттерна метилирования.   Если мы хотим нацелиться на определенный геном и знаем его паттерн метилирования, мы можем рационально подобрать ферменты рестрикции, которые будут разрезать определенную последовательность, называемую мотивом метилирования. Ферменты переварят подавляющее большинство фоновой ДНК, не имеющей такого метилирования. С помощью mEnrich-seq мы можем обогатить интересующие нас бактерии более чем в 100 раз.Как этот протокол соотносится со стандартным экспериментом по метагеномному секвенированию?   Мы действительно учитывали это при разработке. Мы хотели, чтобы он был эффективным и в то же время легко встраивался в существующий конвейер. В итоге mEnrich-seq включает всего два этапа в дополнение к стандартной подготовке библиотеки. На первом этапе, после лигирования адаптера и перед амплификацией, мы дигестируем ДНК с помощью рационально выбранного фермента рестрикции. Если дигестировать ДНК с уже лигированным адаптером, то только неповрежденная ДНК будет иметь лигированные адаптеры на обоих концах и может быть амплифицирована по всей длине. Остальная ДНК будет гораздо короче, что приводит ко второму шагу: после амплификации мы проводим отбор по размеру. Остальные этапы, такие как контроль качества, остаются прежними.Как вы думаете, в каких ситуациях этот метод может быть наиболее полезен?   Одно из применений - борьба с резистентностью к антибиотикам, например, при инфекциях мочевыводящих путей (ИМП). В идеале врачи хотят с высокой чувствительностью выявлять гены резистентности к антибиотикам, которые несет штамм пациента, но в образце мочи много ДНК хозяина и других бактерий. В настоящее время наилучшей практикой лечения ИМП является культивирование образцов мочи, что требует трех дней для получения результата. Это не идеально. Мы хотим быстро, в течение одного дня, составить профиль резистентности к антибиотикам, чтобы врач мог решить, какие антибиотики назначить пациенту".   Другое применение - полезные бактерии, или пробиотики, такие как Bifidobacterium. Разные штаммы могут иметь совершенно разные преимущества для здоровья. Если мы хотим обнаружить пробиотики, связанные с заболеваниями человека или реакцией на лекарства, нам необходимо провести предварительный скрининг, чтобы сузить круг видов в образцах фекалий и выявить более перспективных кандидатов. Многие специалисты заинтересованы в этих приложениях, и мы считаем, что mEnrich-seq обеспечивает новый, более чувствительный, надежный и экономически эффективный способ решения этих проблем".