Как биологи-синтетики создают более эффективные биофабрики
#фармацевтическая микробиология #исскуственный интелект #nad #синтетические нуклеотиды #структурная биология #биосинтез #оксилительно-восстановительные кофакторы (nrc) #биопроизводство #ферменты #ферментеры #синтетическая биология #метаболическая инженерия
Искусственные доноры и акцепторы электронов расширяют возможности исследователей в области метаболической инженерии - если только клетки будут с ними сотрудничать.
Ученые уже несколько десятилетий используют микроорганизмы для производства полезных химических веществ. Предоставив микробам ферменты и метаболические процессы, исследователи могут заставить клетки производить все - от пищевых добавок до биотоплива.
Одним из преимуществ биопроизводства является экологичность: процессы, как правило, более безопасны для окружающей среды, чем химические методы производства. Но это дорого, главным образом потому, что клетки не будут создавать что-то просто потому, что этого хотят исследователи. Например, ферменты, необходимые для производства топливного этанола из растительных сахаров, должны конкурировать за энергию с собственными ферментами метаболизма клетки, и в результате их выход может быть низким.
Создание сложных продуктов, таких как фармацевтические препараты, может включать множество этапов, выполняемых несколькими ферментами. Когда способность клетки развиваться противопоставляется ее способности производить ненужный ей продукт, "клетки всегда выбирают рост", - утверждает Брайан Пфлегер, биолог-синтетик из Университета Висконсина-Мэдисона.Вместо того чтобы пытаться выиграть эту метаболическую войну за ресурсы, некоторые исследователи пытаются обойти ее стороной, внедряя параллельные пути биосинтеза, которые не будут мешать естественным процессам. Они сосредоточились на кофакторах: небольших органических молекулах, которые связываются с ферментами и отдают (восстанавливают) или принимают (окисляют) электроны, необходимые ферментам для работы. Многие из этих "окислительно-восстановительных" реакций, в ходе которых химические группы добавляются, вычитаются или реструктурируются в соединениях, энергетически дороги для клеток. Проблема усугубляется тем, что некоторые реакции требуют наличия "восстановительной" среды, а другие - "окислительной"; добиться того, чтобы в одной и той же клетке существовали оба условия, практически невозможно.
Создание синтетических окислительно-восстановительных кофакторов, которые могут использоваться только синтетическими ферментами, позволяет полностью обойти естественный механизм клетки и исключить конкуренцию между двумя этими процессами. "Это все та же природная инфраструктура", - отмечает Хань Ли, инженер-химик и биолог из Калифорнийского университета. По ее словам, эти неканонические окислительно-восстановительные кофакторы (NRC) могут позволить биологам-синтетикам создавать химические реакции, которые либо совершенно новые для природы, либо более эффективные, чем те, которые катализируются существующими ферментами.
Группа Ли входит в число тех, кто занимается разработкой NRC и ферментов для их использования. Они уже разработали синтетические системы, которые дают больше продукта, чем предыдущие попытки. Но это нелегко. Исследователям необходимо найти способы эффективного производства NRC, обеспечить, чтобы кофакторы и ферменты не вредили клеткам, и модифицировать каждый фермент, чтобы он принимал NRC, не нарушая при этом его нормальных функций.
Масштабирование производства NRC до промышленных масштабов принесет еще больше проблем. Но некоторые исследователи считают, что NRC могут изменить химическое производство, сделав биопроизводство более дешевым, простым и жизнеспособным. "Сейчас биопроизводство не может конкурировать с процессами, основанными на использовании ископаемого топлива, из-за стоимости", - говорит Ли. Но по ее мнению, снижение стоимости может привести к уменьшению количества отходов и выбросов.
Универсальная валюта
Идея дополнить процессы биопроизводства параллельным набором кофакторов возникла как минимум в 1950-х годах, когда исследователи начали находить способы синтеза альтернативных соединений и искать редкие ферменты, способный эффективно их использовать. Но искусственные кофакторы были непомерно дороги в производстве. А поскольку природные ферменты могли переключаться между синтетическими и природными кофакторами, то страдали и клетки, и биопроизводство. Создание ферментов, которые специально использовали бы неканонические кофакторы, оказалось еще более сложной задачей, пока достижения в области генетики и структурной биологии не сделали белковую инженерию относительно простым процессом.
Ли вдохновили работы по созданию синтетических нуклеотидов, которые можно было вставлять в ДНК, что позволило генетическим последовательностям использовать шесть различных нуклеотидов вместо четырех и резко расширить количество аминокислот, которые теоретически могла кодировать ДНК. Если ту же идею применить к клеточному метаболизму, рассуждает она, это позволит расширить типы продуктов, которые могут производить клетки. "Почему бы не сделать это и для универсальной валюты жизни?" - говорит она. Кофакторы - это действительно универсальная валюта. Растительные, животные и микробные клетки используют одни и те же органические молекулы для запуска ферментативных реакций, например АТФ для получения энергии и S-аденозилметионин (SAM) в качестве источника метильных и серосодержащих химических групп.
Одним из наиболее распространенных кофакторов является никотинамид аденин динуклеотид (NAD), который вместе со своей фосфорилированной формой NADP управляет метаболическими процессами, например, расщеплением глюкозы на углекислый газ и воду. Эти кофакторы существуют в двух конфигурациях: восстановленная форма (NADH), которая отдает электроны, и окисленная форма (NAD+), которая их принимает. Геномный анализ бактерии Escherichia coli показал, что этот микроорганизм использует NAD в 127 ферментативных реакциях, а NADP - еще в 113. NAD "занимает центральное место в жизни и во всем, что мы понимаем", - поясняет Рууд Вейстуис, инженер-микробиолог из Вагенингенского университета в Нидерландах.
Но эта центральная роль также означает, что, когда биоинженер хочет заставить микробы производить новый продукт - например, искусственный аромат, - они сталкиваются с большой конкуренцией за NAD. Простое снабжение клеток большим количеством кофакторов не поможет, потому что метаболизм в клетках просто ускорится. И если есть выбор, природные ферменты предпочитают проводить более простые реакции, не требующие много энергии, поэтому инженерам сложно ограничить использование электронов. "Электроны важны, и мы не хотим тратить их впустую, - говорит Вейстуис. NRC могут изменить этот баланс сил". Одним из наиболее перспективных является никотинамид-мононуклеотид (NMN), субъединица NAD. Бактериальные клетки естественным образом синтезируют небольшое количество NMN при производстве нуклеотидов, из которых состоят ДНК и РНК, а добавление в клетки определенных ферментов может увеличить его производство.
В своей работе, опубликованной в 2019 году, группа Ли внесла четыре изменения в фермент под названием глюкозодегидрогеназа, в результате чего он стал в 10 миллионов раз чаще использовать NMN, чем NAD. Соединив этот модифицированный фермент с другим, который может естественным образом использовать NMN, группа успешно заставила E. coli производить фармацевтический продукт под названием леводион, используя только искусственные кофакторы. По словам исследователей, в результате этой подмены было произведено примерно столько же леводиона, сколько клетки могли бы произвести с помощью ферментов, использующих только NAD, а дальнейшее изменение структуры фермента может повысить его эффективность.
Группа Ли также использовала NMN для более сложных синтезов, в том числе химического вещества цитронеллаля, связанного с запахами. Цитронеллаль трудно получить, поскольку клетки быстро превращают его в другие продукты. Инженерия определенных ферментов, использующих исключительно NMN вместо NAD, позволила цитронеллалю накапливаться в клетках. Но группа Ли обнаружила, что при высоких концентрациях NMN+ страдает рост клеток, что подчеркивает хрупкий баланс, с которым сталкиваются метаболические инженеры. Ли подчеркивает, что в этой области еще предстоит понять, как работают природные ферменты, на которые влияет NMN+, и исследователям, возможно, придется оптимизировать работу своих бактерий в каждом конкретном случае.
Помимо NMN
Другие исследователи изучают различные NRC. Зонгбао Чжао, биоинженер из Даляньского института химической физики в Китае, разрабатывает ферменты для использования кофактора под названием никотинамид-цитозин-динуклеотид (NCD), в котором вместо аденина в NAD используется нуклеотид цитозин. В отличие от NMN, NCD является полностью искусственным: клетки не производят его естественным образом, хотя ферменты могут быть сконструированы таким образом, чтобы использовать его в качестве кофактора. Чжао надеется, что эта особенность предотвратит "перекрестные помехи" между биосинтетическим и естественным метаболическими путями, которые могут использовать NMN вместо NAD, когда уровень NMN высок, оставляя тем самым меньше для нужных реакций синтеза.
Группа Чжао изменила два фермента в метаболическом механизме E. coli, который производит малат - предшественник молочной кислоты - таким образом, чтобы они использовали NCD вместо NAD. По словам Чжао, его конечной целью является создание биотоплива, такого как биодизель, которое можно будет "заливать" в двигатели внутреннего сгорания без необходимости модификации двигателей.
Разделение природных и биосинтетических процессов может сделать процесс производства более экологичным, считает Пабло Никель, биотехнолог из Технического университета Дании. "Похоже, промышленность жаждет этого". По его словам, для производителей химикатов, использующих микроорганизмы для превращения природных веществ в полезные химикаты, это может решить две основные проблемы: потребность в ископаемом топливе в качестве субстрата и производство токсичных побочных продуктов.
Группа Никеля, например, пыталась найти способы заставить бактерии производить фторсодержащие предшественники таких соединений, как политетрафторэтилен (тефлон), которые очень токсичны при производстве. Его группа специализируется на Pseudomonas putida - виде, который процветает в токсичных условиях. В 2020 году группа описала генетические схемы, которые заставляют эту выносливую бактерию добавлять фтор к глюкозе и другим химическим веществам - биологический процесс, который редко встречается в природе. Теперь специалисты пытаются включить в этот процесс NRC в надежде сделать этот сложный процесс более эффективным и, в конечном счете, привести в действие реакции с использованием углекислого газа, захваченного из атмосферы.
"Мы заменяем производство, зависящее от нефти, более экологичными производственными системами", - говорит Никель.
NAD - не единственный окислительно-восстановительный кофактор, который можно заменить синтетическими аналогами. Стефан Хаммер, химик-органик из Университета Билефельда в Германии, и его команда разрабатывают аналоги SAM, который участвует в реакциях, добавляющих метильные группы или группы серы, называемые сульфониевыми, к химическим соединениям.Реакции сульфония редко встречаются в природе и Хаммер говорит, что возможность управлять ими с помощью синтетических заменителей SAM может позволить исследователям производить фармацевтические препараты или маркировать белки, чтобы их можно было отслеживать в клетках. "Если у вас потенциально есть новые кофакторы и новые реакционные способности, вы можете расширить возможности природы", - говорит он. Но хотя его группа нашла способ синтезировать большое количество различных аналогов SAM в клетках, их включение в синтетические пути было затруднено из-за низкой активности ферментов, уточняет он.
Научная фантастика... в клетках
Действительно, NRC представляют собой проблему на нескольких уровнях, говорят специалисты. В идеале они должны работать с инженерными ферментами, но не взаимодействовать с существующими ферментами, объясняет Каролина Пол, химик-биолог из Делфтского технологического университета в Нидерландах. Ее группа работает над NMN, создавая ферменты, которые используют только его, а не меняют его на NAD. Исследователи также находят способы модифицировать NMN и другие кофакторы с помощью химических хвостов, которые адаптируют соединения к определенным ферментам, таким как монооксигеназы, которые клетки используют для создания сигнальных молекул. В конечном итоге исследователи смогут использовать такие конструкции для использования различных NRC на разных этапах реакции в одной и той же клетке. На данный момент сотрудники Пол сосредоточились на производстве молочной кислоты и этанола, поскольку эти системы хорошо изучены. Затем она надеется перейти к сложным химическим веществам, таким как те, что используются в парфюмерии.
Именно здесь NRC могут быть особенно полезны, говорит Ричард ван Краненбург, биотехнолог амстердамской компании Corbion, ведущего мирового производителя промышленной молочной кислоты. "Я не думаю, что мы сможем улучшить производство молочной кислоты", - говорит он. Включение NRC и инженерных ферментов потребует от производителей создания новых производственных процессов для получения химического вещества, которое микроорганизмы естественным образом производят очень эффективно.
Однако снижение затрат может сделать биопроизводство более жизнеспособным для таких химических веществ, как натуральные растительные фитоэстрогены, которые используются в некоторых лекарствах от рака. Для растений синтез фитоэстрогенов - сложный, многоступенчатый и неэффективный процесс, в котором участвует множество ферментов, говорит Джулс Биквильдер, химик-биолог из компании BASF. Компании могли бы поместить эти ферменты в дрожжи или бактерии и, возможно, производить химикат в ферментационной емкости, но множество производственных этапов означает, что энергия теряется в течение всего процесса. В таких случаях увеличение объема производства может оправдать дополнительные расходы, говорит ван Краненбург. "Стоимость среды не имеет значения, и, возможно, даже стоимость кофактора не имеет значения, если продукт достаточно ценен".
Биквильдер и ван Краненбург говорят, что они в восторге от потенциала NRC. "Возможно, будет здорово контролировать окислительно-восстановительные условия, не влияя на физиологию организма", - считает Биквильдер. Но он добавляет, что расширение их масштабов для удовлетворения потребительского спроса сопряжено с определенными трудностями, такими как поддержание различных уровней кислорода, необходимых для различных ферментативных реакций. И хотя исследователи часто знают, что делает каждый фермент, они могут не понимать биофизику настолько хорошо, чтобы суметь модифицировать фермент, чтобы он принял NRC. "Это не так, что вы можете нажать кнопку на компьютере и все будет сделано", - говорит он.
При этом достижения в области искусственного интеллекта (ИИ) делают инженерию ферментов намного проще, чем это было всего несколько лет назад. "Идея о том, что мы должны кристаллизовать белок, уходит в прошлое", - говорит Пфлегер, имея в виду классический метод структурной биологии - рентгеновскую кристаллографию. "Способность наделять белки новыми функциями или создавать их с нуля ускоряется с бешеной скоростью". В то же время такие инструменты искусственного интеллекта, как AlphaFold и RoseTTAFold, учатся расшифровывать структуру ферментов на основе их последовательностей и могут предсказать, как конкретные модификации - например, новая форма, позволяющая ферменту принимать NMN вместо NAD, - повлияют на его функции. Ли говорит, что она "очень взволнована" возможностями искусственного интеллекта и надеется однажды собрать достаточно данных, чтобы выяснить, какие модификации необходимы для работы любого фермента с NRC, и начать автоматизировать процесс их создания. Ее группа уже начала разрабатывать принципы дизайна, которые позволят ферментам переключать свое предпочтение с NAD на NMN.
Возможно, исследователи даже смогут модифицировать некоторые ферменты, работающие на NRC, чтобы они были мощнее своих природных аналогов или работали при температурах, кислотности или уровне кислорода, отличных от тех, которые обычно требуются природным ферментам. Если ферменты окажутся достаточно универсальными, то, по оценкам Ли, реакции с использованием NMN могут оказаться значительно дешевле, чем с использованием NAD, благодаря повышенной эффективности и, возможно, более низкой стоимости производства NMN по сравнению с NAD.
Тем не менее, исследователи предпочли бы быть как можно более эффективными. В природе биосинтетические окислительно-восстановительные реакции сопряжены со вторичными реакциями, в ходе которых NADH перерабатывается в NAD+ или наоборот, что позволяет клетке продолжать биосинтез. Исследовательские группы, включая группу Ли, разрабатывают ферменты для "рециркуляции", которые могут переключать NMN+ на NMNH и обратно, создавая в клетке окислительные или восстановительные условия, не зависящие от NAD. В конечном итоге Ли надеется найти или разработать универсальный фермент рециркуляции или электрод, который сможет переключать любой NRC обратно в его окисленную или восстановленную форму, в зависимости от того, что требуется искусственному пути биосинтеза.
Хаммер отмечает, что не каждый фермент в сложном пути синтеза должен зависеть от NRC: сконструированные ферменты могут быть использованы для особо неэффективных проблемных мест или для внесения небольших изменений в соединение, которое клетка уже произвела. По мере расширения списка NRC, говорит Вейстуис, возможности биосинтеза будут безграничны.
"Это научная фантастика, но не в космосе, а в клетках".
