Исследователи адаптировали методы микроскопии для выявления редких случаев Cryptococcus neoformans в мозге и легких мышей.
До выхода сериала "Последние из нас" люди редко думали о грибках в контексте смертельных инфекционных заболеваний. Однако Cryptococcus neoformans - это грибковый патоген, вызывающий более 100 000 смертей в год. Хотя исследователи знали, что C. neoformans проникает в мозг уже через несколько часов после заражения мышей, механизмы, лежащие в основе этого вторжения, были плохо изучены.
Чтобы понять этот процесс, исследователям необходимо выявить редкие случаи грибковой инвазии в мозг, но поиск таких примеров требует возможности изучения больших участков органа. Каролина Коэльо, иммунолог-миколог из Центра медицинской микологии Медицинского исследовательского совета при Эксетерском университете, и ее коллеги решили эту проблему, адаптировав микроскопию с высоким разрешением для более глубокого изучения инфекции мозга. Результаты их исследований, опубликованные в журнале mBio, предлагают исследователям новые возможности для изучения патогенеза C. neoformans.
При стандартной флуоресцентной микроскопии ученые получают изображения тонких срезов тканей, но из-за непрозрачности тканей они извлекают из них ограниченную информацию. Коэльо искала подход, который позволил бы ей преодолеть это ограничение. "Одна из важных вещей - сохранить архитектуру ткани, потому что вам нужно видеть пространственную структуру", - поясняет она.
В ходе поисков Коэльо узнала о протоколах осветления и обесцвечивания, используемых в микроскопии плоскостного освещения для получения изображений целых органов. Хотя ей не нужно было визуализировать весь орган, она использовала этапы протокола по очистке тканей для образцов легких и мозга мышей, зараженных C. neoformans. Это позволило группе Коэльо визуализировать срезы тканей толщиной 200 микрометров. "Этот метод улучшит работу любого микроскопа, который у вас есть, просто потому, что он делает ткани прозрачными", - объясняет она. "Это большой шаг к пониманию взаимодействия хозяин-патоген", - считает Кием Ву, биохимик, изучающий инвазию C. neoformans в Калифорнийском университете, который не принимал участия в исследовании.
Увеличение возможностей визуализации позволило группе Коэльо визуализировать увеличенные грибковые клетки, называемые клетками-титанами, в легких и носовой полости. Они заметили, что эти клетки-титаны и нормальные дрожжевые клетки прилипают к слизистой оболочке носа и вторгаются в нее уже через 24 часа после интраназального инфицирования. Предыдущие работы показали, что клетки-титаны способствуют патогенности грибков, но они были обнаружены преимущественно в легких.
"На ранней стадии инфекции в верхних дыхательных путях они оказываются в непосредственной близости от мозга, так что, возможно, именно так они попадают в мозг", - полагает Фелипе Сантьяго-Тирадо, клеточный биолог из Университета Нотр-Дам, изучающий патогенез C. neoformans и не участвовавший в этой работе. Ву разделяет эту идею, называя ее потенциальной областью для будущих исследований. "Является ли то, что они обнаружили в этой работе редким событием? Или это нечто, что происходит с большей частотой по мере прогрессирования инфекции?"
Хотя ученым известно, что C. neoformans инфицирует мозг, они не знали, попадают ли они в эту ткань в виде свободных грибков, распространяющихся с кровотоком, или путем проникновения в иммунные клетки и последующей переправки через гематоэнцефалический барьер. Коэльо и ее сотрудники изучили легкие интраназально инфицированных мышей с помощью метода осветления и визуализации, чтобы ответить на этот вопрос. Исследователи наблюдали грибковые клетки внутри кровеносных сосудов в легких одного животного через семь дней после заражения. Взятие проб крови и проведение стандартного культивирования с подсчетом также подтвердило, что кровь содержала грибковые клетки уже через три дня после интраназального заражения. "Самое замечательное в этом то, что они, по сути, показывают, что те вещи, которые предполагались по косвенным признакам или с помощью анализов in vitro, теперь стали видны in vivo", - говорит Сантьяго-Тирадо.
Поскольку C. neoformans проникает в кровь, авторы исследования внутривенно заразили мышей грибковыми клетками, чтобы изучить инфекцию в мозге. Они заметили, что C. neoformans проникает в мозг в течение 24 часов после заражения и преимущественно существует в скоплениях грибковых клеток. Исследователи пометили кровеносные сосуды и микроглию мозга, чтобы подтвердить, что грибки преодолели гематоэнцефалический барьер, и определить, связаны ли они с резидентными иммунными клетками.
Таким образом, исследование показало колонизацию верхних дыхательных путей C. neoformans в мышиных моделях наряду с быстрым распространением в мозг, независимо от пути заражения. Быстрое появление дрожжевых клеток в различных тканях организма, где они инициируют местный иммунный ответ, позволяет с осторожностью связывать определенный системный ответ с конкретной тканью. Результаты свидетельствуют о необходимости пересмотреть давно устоявшиеся взгляды на патогенез криптококка в животных моделях инфекции с использованием самых современных клеточных и иммунологических методик. В дальнейшем Коэльо планирует изучить молекулы, выделяемые грибками и клетками хозяина, которые влияют на их взаимодействие.
