Микробиота кишечника человека представляет собой многообразную экосистему, включающую тысячи микробов, каждый из которых обладает различной функциональной активностью.
Ее значение для здоровья человека является растущей областью биомедицинских исследований. Одним из объектов пристального интереса в области коммуникации хозяин-микробиота в последнее время стали внеклеточные везикулы (EVs), секретируемые микробиотой кишечника. EVs - мембранно-замкнутые частицы, секретируемые практически всеми типами клеток, - могут переносить различные биомолекулы через биологические барьеры.
Концепция микробиома плода остается предметом дискуссий. Хотя в предыдущих исследованиях сообщалось о наличии бактериальной ДНК в плаценте и амниотической жидкости, идея о существовании отдельной микробиоты плода, состоящей из полноценных клеток бактерий, была встречена скептически. Влияние EVs, полученных из единичных лабораторных патогенов, на фетально-материнский интерфейс и модуляция секреции бактериальных EVs в моче во время беременности уже были обнаружены у человека. Однако данные о микробных EVs при здоровой беременности немногочисленны, а EVs, продуцируемые микробиотой, не исследовались в среде плода.
Мы предположили, что EV, продуцируемые материнской микробиотой, преодолевают биологические барьеры и достигают плода. Мы поставили перед собой цель охарактеризовать бактериальные EVs в кишечнике и амниотической жидкости здоровых беременных женщин. Кроме того, мы изучили, взаимодействуют ли EV, продуцируемые микробиотой материнского кишечника, с плодом на мышиной модели.
Результаты настоящего исследования показали, что EV, продуцируемые микробиотой, присутствуют в амниотической жидкости беременных женщин. Примечательно, что EV, обнаруженные в амниотической жидкости и материнском кале, имеют сходство по белковому грузу и бактериальному составу. На мышиной модели мы успешно выделили EVs из образцов материнского кала, которые, как было показано, попали во внутриамниотическое пространство. Мы обнаружили, что EVs, происходящие из материнской микробиоты, могут попадать в среду плода, что представляет собой ранее не описанный механизм взаимодействия между микробиотой материнского кишечника и развивающимся плодом. Присутствие в амниотической жидкости EVs, продуцируемых микробиотой материнского кишечника, позволяет предположить вероятный механизм прайминга иммунной системы плода, который имеет решающее значение для колонизации кишечника новорожденного после рождения.
Предыдущие исследования бактериальных EVs в среде плода часто фокусировались на изучении влияния EVs, выделенных из отдельных патогенных штаммов бактерий, на животных моделях, изучающих осложнения беременности. Кроме того, исследования присутствия бактерий в среде плода в основном основывались на секвенировании гена 16S рРНК, а другим биомолекулам бактериального происхождения уделялось ограниченное внимание. В недавнем исследовании Nunzi et al. изучался потенциал активации моноцитов EVs, полученными из амниотической жидкости, и сообщалось о присутствии бактериальных EVs в амниотической жидкости человека с помощью секвенирования гена 16S-рРНК. Аналогичным образом Menon et al. исследовали плацентарный микробиом с помощью секвенирования генов 16S рРНК бактериальных EVs из плаценты. В отличие от предыдущих работ, в нашем исследовании применен более комплексный подход: помимо анализа генов 16S рРНК, бактериальные EVs, полученные из амниотической жидкости, охарактеризованы с помощью протеомики, что позволяет провести прямое сравнение с EVs микробиоты материнского кишечника.
Настоящее исследование показало наличие бактериальных EVs в амниотической жидкости человека, о чем свидетельствуют бактериальные белки и РНК. Протеомный анализ в настоящем исследовании выявил подгруппу бактериальных белков, присутствующих как в EV, полученных из амниотической жидкости, так и в EV, полученных из материнских фекалий. Белковый груз в обеих группах EV происходил в основном из одних и тех же бактериальных филогенетических групп и имел сходные функциональные характеристики. Несмотря на различия в бактериальной ДНК образцов амниотической жидкости и материнского кала при анализе генов 16S рРНК, EV, выделенные из этих источников, продемонстрировали сходство бактериального состава и разнообразия, что позволяет предположить наличие общего источника. Полученные результаты подтверждают гипотезу о том, что материнская микробиота взаимодействует с развивающимся плодом во время беременности через EVs, продуцируемые микробиотой.
Наши эксперименты на мышиной модели являются дополнительным доказательством того, что EVs, продуцируемые материнской микробиотой, могут попадать к плоду во время беременности. Предыдущие исследования показали, что бактериальные EV обладают способностью преодолевать эпителиальный барьер кишечника, попадать в кровоток и затем транслоцироваться в дистальные органы. Этот феномен ранее был описан либо в связи с обнаружением бактериальных EV, ассоциированных с кишечником, в биологических жидкостях человека, таких как кровь и грудное молоко, либо в результате анализа биораспределения с использованием меченых бактериальных EV в животных моделях, которые проводились вне беременности или с использованием бактерий, полученных из культивированных штаммов комменсальных бактерий. В настоящем исследовании бактериальные EV были выделены из образцов фекалий, представляя собой, таким образом, всю EV-секрецию микробиоты материнского кишечника, для оценки их биораспределения в организме плода.
Меконий новорожденного, сформировавшийся внутриутробно, уже содержит характерную микробиоту, однако концепция микробиома плода, включающая амниотическую жидкость и плаценту, вызывает критику, поскольку характерная микробиота плода, состоящая из цельных клеток бактерий, представляется маловероятной. Однако в исследовании Jimenez et al. сообщалось, что ДНК Enterococcus faecium обнаруживалась в амниотической жидкости и меконии при пероральном введении бактерий беременным мышам. Транслокация EVs, продуцируемых материнской микробиотой, может помочь примирить эти противоречивые результаты и дать потенциальное объяснение присутствию бактериального материала в среде плода без необходимости в живых бактериях. Таким образом, будущие исследования концепции микробиома плода должны учитывать роль EVs, полученных из материнской микробиоты.
Развитие иммунной системы плода начинается на ранних сроках гестации. Mishra et al. предположили, что воздействие микроорганизмов во время гестации приводит к формированию иммунных клеток плода, поскольку они обнаружили присутствие бактерий в различных тканях плода и исследовали активацию фетальных Т-клеток памяти в ответ на воздействие микроорганизмов. Было показано, что помимо комменсальных бактерий микробные метаболиты регулируют адаптивные иммунные реакции в кишечнике, включая модуляцию регуляторных Т-клеток. Бактериальные EVs могут активировать различные иммунные реакции хозяина через патоген-ассоциированные молекулярные паттерны и последующую активацию толл-подобных рецепторов 2 и толл-подобных рецепторов 4. Когда плод заглатывает амниотическую жидкость in utero, бактериальные EVs из амниотической жидкости, вероятно, достигают эпителия кишечника, обеспечивая безопасный путь для раннего бактериального воздействия через эти нереплицирующиеся бактериальные единицы.
Основываясь на результатах настоящего исследования, мы предположили, что EVs, полученные из микробиоты материнского кишечника, присутствующие в амниотической жидкости и, вероятно, попавшие в организм плода, направляют иммунную систему плода на формирование иммунной толерантности, необходимой для ранней колонизации кишечника при рождении. Полученные нами результаты подтверждают идею о том, что бактериальные EVs из материнской микробиоты кишечника являются естественной частью среды обитания плода во время здоровой беременности.
Основное достоинство нашего исследования заключается в комплексном изучении микробиоты материнского кишечника и EVs амниотической жидкости. Кроме того, мы оценили бактериальные EVs в амниотической жидкости по содержанию белка и РНК. Анализ двух различных групп биомолекул позволяет более глубоко понять секрецию EV и их содержимое. Однако следует учитывать некоторые ограничения нашего исследования. Разделение EV, принадлежащих хозяину и микробиоте, остается сложной задачей, и в нашем анализе биораспределения на мышах могла присутствовать смесь EV, принадлежащих хозяину и микробиоте, несмотря на то, что наш протокол выделения предусматривал обогащение бактериальных EV. Кроме того, низкая биомасса образцов при ампликонном анализе гена 16S рРНК создает риск контаминации, который мы устранили, выполнив рекомендации по надлежащей практике и контролю, описанные de Goffau et al. Наконец, хотя мы сосредоточились на изучении EVs, продуцируемых микробиотой кишечника в среде плода, потенциальный вклад бактериальных EVs из других источников, таких как микробиота полости рта или влагалища, требует дальнейшего изучения.
