Инфекционные заболевания являются важной причиной заболеваемости и летальности в популяции новорожденных.
В 2019 году в мире регистрировалось 17 смертей на 100 живорожденных и 6700 неонатальных смертей ежедневно (Gu et al., 2019). В общей сложности 48% случаев смерти новорожденных старше 7 дней могут быть связаны с микробными инфекциями, которые являются основной причиной смерти в этот период. Обычные микробиологические тесты обычно имеют длительное время выполнения и низкую чувствительность. Золотым стандартом идентификации микроорганизмов является культура. Однако низкая частота выделения культуры при неонатальных инфекциях обусловлена несколькими факторами, включая ограниченный объем образца, наличие перемежающейся бактериемии и внутриутробное воздействие противомикробных механизмов матери.
Частота выделения культуры варьирует от 3-10,29% при сепсисе с ранним началом до 16,7-33% при сепсисе с поздним началом. Другие широко используемые не культуральные тесты, такие как анализ крови и соотношение незрелых и общих нейтрофилов (I/T ratio), могут быть использованы для предположения бактериальной инфекции. Воспалительные сывороточные маркеры, включая С-реактивный белок (CRP), прокальцитонин (PCT) и цитокины (интерлейкин 6, интерлейкин 8, фактор некроза опухоли α и т.д.) также могут использоваться для индикации микробных инфекций, хотя и с низкой специфичностью. С развитием молекулярной биологии были разработаны ПЦР и секвенирование 16S/18S рРНК, но которые имеют ограниченный круг целей. Поэтому необходим высокоточный диагностический тест для широкого выявления патогенов.
Метагеномное секвенирование следующего поколения (mNGS) не зависит от культуры и позволяет непредвзято секвенировать нуклеиновые кислоты как хозяина, так и микроорганизмов, выделенных из различных клинических образцов. Его преимущество заключается в обнаружении широкого спектра патогенов и генов резистентности к антибиотикам. Хотя современная технология mNGS продемонстрировала ряд преимуществ, все еще существуют проблемы для клинического применения:
(1) количество немикробной ДНК, присутствующей в клинических образцах (в основном полученных из клеток человека), негативно влияет на диагностическую чувствительность обнаружения микроорганизмов;
(2) количество микробных считываний нельзя сравнивать между образцами, что делает маловероятным оценку изменений патогенной нагрузки при проведении нескольких анализов mNGS для одного и того же пациента.
Принимая во внимание вышеупомянутые проблемы, мы разработали подход количественного метагеномного секвенирования для мониторинга количества микроорганизмов в каждом образце, что было достигнуто путем включения внутреннего контроля нуклеиновой кислоты, вводимого во все образцы в постоянной концентрации. В дополнение к мониторингу уровня хозяина, мы также могли бы использовать соотношение микробных прочтений для количественной оценки обилия микроорганизмов. Геномы различных микроорганизмов имеют разную длину и содержание GC. Поэтому на основе этого соотношения вряд ли можно напрямую экстраполировать число копий или колоне-образующих единиц. Однако это соотношение не зависит от нуклеиновой кислоты хозяина и, таким образом, может лучше, чем количество прочтений (RPM), отражать патогенную нагрузку.
В этом исследовании мы провели количественное метагеномное секвенирование для неонатальных пациентов с тяжелыми инфекциями, у которых обычные методы не позволили выяснить этиологию. Мы сообщаем о следующих случаях инфекций, которые были успешно диагностированы с помощью mNGS и затем успешно излечены.
Согласно отчетам ВОЗ в 2018 году около 10 000 новорожденных во всем мире были инфицированы Mycobacterium tuberculosis, из них на долю женщин и детей младше 15 лет приходится 32 и 11% случаев туберкулеза соответственно (ВОЗ, 2019). Внутриутробная инфекция Mycobacterium tuberculosis, получила название врожденного туберкулеза, который является редким типом, но может привести к высокой летальности. В литературе сообщается о не более чем 400 случаях в мире с ограниченным опытом лечения инфекции M. tuberculosis. Симптоматика врожденного туберкулеза охватывают респираторные, неврологические и желудочно-кишечные расстройства. Появление симптомов у младенцев, как правило, происходит быстрее, чем у детей старшего возраста и взрослых. У самых больных младенцев может развиться дыхательная недостаточность, шок, диссеминированное внутрисосудистое свертывание крови и множественная органная недостаточность.
Врожденный туберкулез трудно диагностировать из-за атипичных клинических проявлений. В клинической практике из-за различий в иммунных функциях новорожденных время появления симптомов значительно варьирует. Varik et al. (2012) сообщили, что симптомы врожденного туберкулеза проявляются в течение 3 недель после рождения, а средний возраст начала заболевания составляет 28 дней. В нашем случае у 19-дневного мальчика наблюдались лихорадка и тахипноэ, а также признаки дыхательной недостаточности. Даже после идентификации при помощи mNGS культура Mycobacterium tuberculosis в периферической крови, мокроте и БАЛ в течение 21 дня оставалась отрицательной. Этиологический диагноз позволил сократить продолжительность пребывания в стационаре (средняя продолжительность 36,5 дней) и улучшить прогноз пациента.
Legionella pneumophila может вызывать пневмонию, но редко встречается у новорожденных. Molly et al. сообщили о 6-дневном новорожденном, инфицированном L. pneumophila, у которого быстро развился тяжелый ОРДС. Клинические проявления болезни легионеров у новорожденных включали лихорадку, кашель, тахипноэ, пневмонию при рентгенографии грудной клетки, острый респираторный дистресс и сепсис. При диагностике легионеллеза предпочтение отдается образцам из нижних дыхательных путей (мокрота, БАЛ и т.д.), а культивирование обычно занимает 3-5 дней. Тест на антиген в моче также является диагностическим тестом первой линии, хотя он ограничен серогруппой 1 Legionella pneumophila. Макролидные и хинолоновые антибиотики предлагаются в качестве первой линии терапии тяжелой легионеллезной пневмонии (Cunha et al., 2016).
В нашем случае у пациента наблюдалась лихорадка и прогрессирующая дыхательная недостаточность, что потребовало проведения механической вентиляции легких. Антиген в моче и культура БАЛ были отрицательными. Антитела IgM в крови, mNGS в БАЛ и секвенирование 16s рРНК были положительными на L. pneumophila. У нашего пациента эмпирические антибиотики сначала были заменены с амоксициллина на меропенем, ни один из которых не был эффективен против L. pneumophila. После установления этиологического диагноза был назначен эритроцин с удовлетворительными результатами.
Из-за незрелой иммунной системы и длительной механической вентиляции новорожденные особенно восприимчивы к диссеминированным инфекциям, вызванным организмами из окружающей среды, такими как B. cereus. B. cereus обычно связан с зараженной пищей и может привести к пищеварительным проявлениям и эндофтальмиту. Несмотря на небольшое количество зарегистрированных случаев инфекции B. cereus у младенцев, многие из них были смертельными. Так, 12 (75%) младенцев умерли, большинство из них - в течение 3 дней после начала заболевания. У четырех выживших младенцев развился церебральный паралич. Визуализационные характеристики включали геморрагический менингоэнцефалит, который сначала поражал белое вещество, а затем кору и базальные ганглии.
У нашего пациента наблюдались аналогичные особенности визуализации в виде очагов энцефаломаляции в белом веществе, а затем в коре и базальных ганглиях. Культуры ЦСЖ, мокроты и крови были отрицательными. Но mNGS ЦСЖ и секвенирование 16s рРНК были положительными в отношении B. cereus. Из-за наличия бета-лактамазы, которая делает ее резистентной к большинству пенициллинов и цефалоспоринов, эффективными антибиотиками являются хлорамфеникол, клиндамицин, ванкомицин, эритромицин и аминогликозиды.
Наше исследование имело несколько ограничений. Во-первых, это исследование имело небольшой размер выборки и не позволило в достаточной степени оценить клиническую пользу и недостатки mNGS у неонатальных пациентов. Во-вторых, существуют проблемы, связанные с применением mNGS в клинических условиях, такие как стоимость, сложность теста и отсутствие экспериментальных стандартов. В-третьих, интерпретация результатов была затруднена при дифференциации причинных патогенов от колонизирующих или контаминирующих микроорганизмов. Наконец, все пациенты получали эмпирическую антибиотикотерапию до проведения mNGS, что могло негативно повлиять на аналитическую чувствительность обнаружения микроорганизмов, несмотря на то, что во всех случаях результаты были положительными.
