Исследователи переписывают химические метки на ДНК и хроматине, чтобы регулировать экспрессию генов.
Генетик из Университетского медицинского центра Гронингена (Нидерланды) Марианна Ротс впервые заговорила на конференциях о редактировании эпигенома около двух десятилетий назад. Она рассуждала так: если естественные эпигенетические метки, такие как метилирование ДНК и ацетилирование гистонов, контролируют экспрессию генов, то искусственное изменение этих меток должно позволить ученым регулировать эту экспрессию. Но многие ее коллеги сомневались, полагая, что эпигенетические метки не могут вызывать такие изменения. «Нам действительно пришлось бороться с догмами, что это никогда, никогда не сработает», — вспоминает Ротс.
Затем появилась система CRISPR–Cas. Хотя эта технология впервые произвела фурор в области редактирования генов, ученые, такие как Ротс, теперь используют ее для точного нацеливания эпигенетических редакторов на любую последовательность ДНК. Внезапно исследователи в области эпигенетики получили возможность не только подавлять или активировать гены, но и регулировать экспрессию генов в большую или меньшую сторону. Более десятка компаний сейчас изучают технологии эпигенетического редактирования и проводится несколько клинических испытаний на ранних стадиях.
Эпигенетическое редактирование, обладающее возможностью регулировки и гибкостью, элегантно контрастирует с редактированием генов. Фермент Cas системы CRISPR разрезает генетический материал, а затем использует клеточные системы для его восстановления, надеясь внести желаемые изменения. Эпигенетическое редактирование более щадящее, оставляя нити ДНК и код неизменными, и может вызывать как временные, так и постоянные изменения. «Я считаю редактирование эпигенома гораздо более сложным и комплексным процессом», — говорит биомедицинский инженер Чарльз Герсбах. «С помощью редактирования эпигенома можно сделать гораздо больше вещей, которые не всегда выполнимы при редактировании генома».
Например, при эпигенетическом редактировании добавление нескольких направляющих РНК — нуклеиновых кислот, которые направляют фермент Cas в определенное место в геноме —позволяет ученым изменять несколько участков одновременно. В отличие от этого, поскольку редактирование гена требует создания двуцепочечного разрыва ДНК, редактирование нескольких последовательностей генов одновременно сопряжено с риском соединения фрагментов в неестественных, опасных конфигурациях.
Исследователи используют эпигенетическое редактирование для изучения тонкостей экспрессии генов и разработки методов лечения. Ученые-растениеводы также работают с эпигеномами, создавая варианты сельскохозяйственных культур, которые отличаются не последовательностью ДНК, а активностью генов. Но эпигеном сложен и многие проекты сопровождаются пробами и ошибками. «Мы действительно не понимаем правил», — говорит Ротс. «Мы не можем предсказать конечный результат наших биологических экспериментов».
Неудивительно, что правила неясны: «Эпигенетических модификаций множество», — говорит нейробиолог Элизабет Хеллер. Молекула ДНК может быть модифицирована метилированием, которое может подавлять гены, а связанные с ней гистоны подвергаются десяткам возможных химических модификаций, включая ацетилирование, фосфорилирование и биотинилирование, каждая из которых имеет свой собственный механизм действия. «Даже в данном гене обычно происходит множество изменений одновременно», — поясняет Хеллер.
В клетках человека экспрессия генов регулируется примерно 900 регуляторами хроматина и 1600 факторами транскрипции — белками, которые связываются с последовательностями ДНК, контролируя скорость экспрессии генов.
Таким образом, одним из первых применений эпигенетического редактирования является исследование механизмов самой эпигенетики. Эпигенетический базовый редактор состоит из двух ключевых частей. Первая — это механизм нацеливания — как правило, это версия фермента Cas из CRISPR, которая не может разрезать ДНК, а также направляющая РНК, которая доставляет его к локусу. Вторая — это эффектор, который вносит изменения или иным образом влияет на экспрессию генов. Некоторые эффекторы представляют собой ферменты, которые непосредственно модифицируют ДНК и гистоны, например, метилтрансферазы и деметилазы. Другие эффекторы не действуют непосредственно на саму ДНК, а привлекают или блокируют транскрипционный аппарат — искусственные факторы транскрипции (ИФТ), как их называют Хеллер и Ротс.
Хеллер говорит, что для временных изменений исследователи могут вводить в клетки плазмиды, кодирующие редактор или ИФТ. Плазмиды могут доставляться несколькими способами, например, в виде ДНК или упакованными внутри короткоживущих вирусных векторов, таких как вирус простого герпеса. Экспрессия редактора или ИФТ и любые связанные с этим изменения будут длиться около недели. Для более длительных изменений исследователи могут использовать лентивирусные векторы, которые интегрируют свои гены в геном клетки-хозяина. Или они могут создавать трансгенные клеточные линии или организмы с геномами, модифицированными для экспрессии редактора или ИФТ. «Наличие всех этих вариантов немного пугает», — говорит Герсбах. «Но в то же время это очень мощный инструмент, обеспечивающий большую гибкость».
Ротс рекомендует начать с нескольких часто используемых эффекторов, многие из которых предоставляет компания Addgene (США). Для повышения экспрессии генов можно рассмотреть VP64 и связанные с ним конструкции — активаторы, основанные на факторе транскрипции вируса простого герпеса 1-го типа. Для снижения экспрессии можно попробовать CRISPRoff, созданный на основе домена транскрипционного репрессора KRAB и комплекса ДНК-метилтрансферазы, который катализирует метилирование. В исследовании 2025 года Герсбах использовал KRAB, VP64 и другой активатор генов, называемый TET1, для изучения регуляции генов при синдроме Прадера-Вилли, который, помимо прочих симптомов, вызывает постоянное чувство голода. Заболевание возникает при делеции копии 15-й хромосомы, унаследованной от отца. Все гены присутствуют на материнской 15-й хромосоме, но они метилированы или выключены. Вместо того чтобы пытаться реактивировать каждый ген на протяжении 5–6 мегабаз генетического материала, Герсбах ищет «главный переключатель», который будет контролировать их все — стратегия, которая, как он надеется, однажды может привести к созданию терапевтического средства.
Чтобы исследовать, как регулируется этот регион, исследователи объединили более 11 000 направляющих РНК либо с VP64 для активации экспрессии подавленного материнского аллеля, либо с KRAB для подавления нормальной отцовской версии. Результаты скрининга и дальнейшая работа с активатором TET1 выявили единственное геномное местоположение, в котором целенаправленное деметилирование активировало подавленные гены даже после того, как редактор исчез.
В Институте генной терапии Сан-Раффаэле (Италия), молекулярный биолог Анджело Ломбардо также имеет терапевтические амбиции в области эпигенетического редактирования. В 2016 году Ломбардо описал метод, который он называет «быстрым редактированием», для достижения долгосрочных изменений от временно экспрессируемых эффекторов. Как и CRISPRoff, система основана на KRAB и ферменте метилтрансферазе, а также на настраиваемых молекулах, нацеленных на ДНК. Кратковременная экспрессия этих конструкций в культивируемых клетках наносила репрессивные метки на ДНК и гистоны целевых генов, навсегда отключая их. Эффект сохраняется в течение нескольких месяцев, на протяжении нескольких циклов клеточного деления, рассказал Ломбардо.
Ломбардо использовал ту же систему для деактивации гена Pcsk9 у мышей. Pcsk9, экспрессируемый в клетках печени, регулирует уровень холестерина; низкомолекулярные ингибиторы PCSK9 могут лечить высокий уровень холестерина, а стратегии редактирования генов для отключения этого гена находятся на стадии испытаний. Группа Ломбардо использовала липидные наночастицы для доставки матричной РНК, кодирующей их эпигенетический редактор, в печень мышей, что почти вдвое снизило уровень PCSK9. Однократная обработка создала эффект, сохраняющийся почти год. Исследователи удалили часть печени у четырех мышей, заставив орган регенерировать — и новая ткань сохранила эпигенетическое подавление, показав, что оно может передаваться от материнской клетки к дочерней.
Ломбардо стал соучредителем компании nChroma Bio (США), для дальнейшего развития эпигенетических методов лечения, подобных этому, и компания продвигает программу PCSK9 на следующие этапы. В экспериментах на мышах исследователи nChroma подавили экспрессию трансгена человеческого PCSK9, что привело к снижению уровня белка более чем на 98% как минимум на год — и им также удалось реактивировать ген, удалив подавляющие метильные метки. В том же исследовании макакам-крабоедам было проведено лечение, которое снизило уровень PCSK9 примерно на 90%, а уровень липопротеинов низкой плотности, или «плохого» холестерина, снизился примерно на 70%.
Как nChroma, так и Tune Therapeutics (США), соучредителем которой является Герсбах, проводят испытания эпигеномных методов лечения гепатита B. Инфицированные клетки печени содержат множество копий вирусного генома: некоторые интегрированы в хромосому хозяина, а другие находятся вне ее. Как объясняет Герсбах, идея этих методов лечения заключается в подавлении вирусных геномов и предотвращении образования вирусных частиц, что приводит к «функциональному излечению». На конференции Европейской ассоциации по изучению печени в Барселоне, Испания, в мае этого года, Тьюн сообщил, что в ходе продолжающегося исследования на ранней стадии более высокие дозы лечения устранили несколько вирусных белковых и РНК-биомаркеров на срок до 17 месяцев.
Ломбардо сейчас объединяет эпигенетическое редактирование с генным редактированием в том, что он называет «универсальной безумной платформой» для терапии рака. В CAR-T-терапии иммунные клетки перепрограммируются с помощью химерных антигенных рецепторов (CAR), которые нацелены на раковые клетки. Но также полезно инактивировать другие гены, которые могут подавлять иммунное действие CAR-T-клеток или заставлять их атаковать неправильные мишени. Ломбардо рассудил, что только добавление CAR требует фактического генетического редактирования; подавление других генов может быть достигнуто с помощью более мягкого эпигенетического подхода.
Задача заключалась в разработке системы, способной расщеплять один целевой участок для вставки гена CAR, одновременно направляя эпигенетические редакторы в другие участки генома. Решение Ломбардо заключалось в использовании направляющих РНК различной длины и активного фермента Cas9, способного разрезать ДНК. Он использовал полноразмерную направляющую РНК для нацеливания на желаемый локус CAR, который Cas9 расщеплял во время полноценного генетического редактирования. Укороченные направляющие РНК, нацеленные на другие участки, были достаточны для привлечения эпигенетических эффекторов — опять же, KRAB и метилтрансфераз — без разрезания ДНК. В мае ученые сообщили, что им удалось успешно экспрессировать CAR и эпигенетически подавить два других гена в 80% клеток в культуре.
Редактирование эпигенома также набирает популярность в сельскохозяйственных науках. Многие признаки растений, такие как их высота и урожайность, контролируются эпигенетикой, объясняет Цзянь-Кан Чжу, молекулярный генетик и президент Макаоского университета науки и технологий в Китае. Редактирование эпигеномов растений может позволить создавать ценные сорта без необходимости изменения последовательности ДНК. Цели и задачи эпигенетического редактирования растений отличаются от целей и задач редактирования у животных, поясняет Чжаобо Лан, эпигенетик из Южного университета науки и технологий (Китай). Она и Чжу хотят, чтобы изменения были не только долговременными, но и наследуемыми, чтобы они влияли на будущие поколения. Таким образом, они стремятся редактировать зародышевую линию растений. Еще одно отличие заключается в том, что им не обязательно важны побочные эффекты от редактирования: если изменение вредно, они могут просто уничтожить затронутые растения. Но иногда эти непреднамеренные изменения оказываются полезными, говорит Чжу.
Лан, Чжу и их коллеги более десяти лет занимались созданием инструментов, комбинируя различные модули, нацеленные на ДНК, эффекторные белки и кофакторы, которые усиливают действие эффекторов в растениях. Они протестировали их на модельном растении Arabidopsis thaliana, подавляя и активируя репортерные гены, которые изменяли сроки цветения. Работа заняла так много времени, говорит Чжу, отчасти потому, что они обеспечили сохранение изменений как минимум в течение трех поколений, а иногда десяти и более. (Одно поколение A. thaliana развивается за четыре-пять недель). Полученный в результате набор методик включает пять ферментов, добавляющих метильные группы к ДНК, и шесть, удаляющих их, с различной специфичностью и эффективностью. Ланг и Чжу советуют исследователям модифицировать эти инструменты, чтобы они были совместимы с другими видами, с которыми они работают. Во-первых, легко перенести гены в A. thaliana, погрузив цветки в суспензию Agrobacterium, рода бактерий, доставляющих трансгены в зародышевые клетки. Но это не сработает для многих сельскохозяйственных культур. Генный промотор, управляющий экспрессией редактора, также специфичен для Arabidopsis.
Хотя эпигенетические манипуляции когда-то казались невозможными, сейчас эта область развивается быстро — возможно, слишком быстро, если говорить о клинических испытаниях, говорит Ротс. Она опасается, что неудачи в исследованиях на людях отбросят всю область назад. «Нам еще многое предстоит узнать и понять», — говорит она. На данный момент это означает, что поиск или разработка подходящего метода может потребовать открытости к различным вариантам. Команда Ломбардо потратила два года на попытки подавить Pcsk9 с помощью таргетинга на основе CRISPR–Cas, прежде чем попробовать вместо этого нуклеазу с цинковым пальцем. Цинковые пальцы — это более старая технология, и их не так просто разработать, но конструкции меньше по размеру, что облегчает их доставку в ткани. «Цинковый палец сработал с первого же теста», — вспоминает он.
По словам ученых, самая большая проблема заключается в доставке генов эффекторов в целевые клетки или ткани. «Чтобы разработать правильные протоколы доставки, требуется год обучения в аспирантуре и это очень расстраивает», — сетует Ротс. Чтобы убедиться, что груз вообще попал в клетку, ученые могут проверить наличие компонентов редактора, таких как Cas9, в целевых клетках. Следующий вопрос: нашел ли эффектор свою цель и избежал ли он внецелевых последовательностей? В этом может помочь хроматиновая иммунопреципитация с секвенированием ДНК, говорит Пилар Бланкафорт, биолог-онколог из Университета Западной Австралии. Биоинформатические инструменты, такие как dsNickFury2 и Elevation, могут идентифицировать потенциальные внецелевые участки для заданных направляющих РНК, помогая ученым определить, действительно ли неожиданные эпигенетические изменения являются результатом внецелевых действий.
Чтобы контролировать активность редактора, следует применять деактивированную версию фермента редактора, предлагает Хеллер. По мнению Ланга, бисульфитное секвенирование может выявить изменения в паттернах метилирования. Затем количественная полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией или секвенирование РНК могут показать любое влияние на уровни РНК. Наконец, чтобы убедиться, что любые измененные фенотипы являются результатом редактирования, Герсбах предлагает попробовать альтернативные инструменты, которые должны дать тот же эффект, или другую направляющую РНК, нацеленную на тот же геномный регион, и посмотреть, совпадут ли результаты.
Тем не менее эпигенетическое редактирование может работать превосходно. Поскольку именно эпигеном в конечном итоге определяет тип клетки, редактирование может быть использовано для того, чтобы перевести клетки рака молочной железы из опасного мезенхимального состояния в эпителиальное состояние, которое более восприимчиво к лечению. Так, эпигенетическое подавление генов, кодирующих четыре транскрипционных фактора, изменило эпигенетические метки в 100 000 сайтах цитозин-гуанин в геноме. «Что касается эффективности, мы очень довольны», — говорит Бланкафорт. «Эпигенетические редакторы действительно работают и работают очень хорошо».
Чтобы поделиться этой новацией с другими исследователями, Ротс и другие ученые разрабатывают руководства, которые будут определять, какие гены будут реагировать на какие эффекторные домены. Она участвует в одном из таких проектов, голландском консорциуме Epi-Guide-Edit, который работает над определением правил редактирования, которые группа описывает как «точные, предсказуемые и долгосрочные». Но это непростая задача, говорит она: хотя группа планирует завершить свой проект к июню 2028 года, на данный момент она изучила влияние отдельных эффекторов только примерно на 100 генов. Сложность не должна пугать, говорит Герсбах: «Просто беритесь за работу».
