Несмотря на успехи современных медицинских технологий в профилактике и лечении большинства заболеваний человека, стремительный рост числа антибиотикорезистентных микроорганизмов и популяций хронических больных, неблагоприятные эффекты, вызванные химическими препаратами, непомерные медицинские расходы, рак и другие неизлечимые заболевания настоятельно требуют высокоэффективных, удобных и экономичных методов решения этих проблем.
Все больше доказательств демонстрируют связь между дисфункцией микробного сообщества человека и возникновением и развитием многих заболеваний человека, что указывает на потенциальное использование микроорганизмов в качестве альтернативной стратегии для решения этих проблем. Примечательно, что бактерии составляют более 90% микроорганизмов кишечника, а достижения синтетической биологии позволяют точно манипулировать бактериями для различных целей.
Например, техническое совершенствование Clustered regularly interspaced short palindromic repeats-cas9 (CRISPR-cas9) и молекулярно-биологических методов (например, синтеза генов, последовательности ДНК/РНК, трансфекции ДНК, методы клонирования больших фрагментов ДНК) в значительной степени способствуют созданию различных сконструированных бактерий для производства многих белков и молекулярных соединений, которые являются продуктами некультивируемых микроорганизмов, грибов, архей, микроэукариот и эукариот.
Все больше фактов свидетельствует о том, что генно-инженерные бактерии (ГИБ) могут вводиться перорально или внутривенно в клинических испытаниях для лечения различных заболеваний. Благодаря своей особой способности колонизировать солидные опухоли, кишечный тракт, дыхательные пути, половые пути и ротовую полость, ГИБ осуществляют свою деятельность, поставляя активные молекулы, вмешиваясь в работу иммунных клеток, сдерживая патогенные бактерии или убивая опухолевые клетки путем экспрессии чужеродных генов или усиления экспрессии эндогенных генов, тем самым предотвращая, диагностируя или излечивая заболевания.
В данном обзоре мы систематически обобщаем последние достижения в бактериотерапии, использующей ГИБ в качестве основного компонента. Наконец, мы описываем доклиническое и клиническое применение ГИБ и нескольких пробиотиков в лечении рака и метаболических заболеваний и обсуждаем их ограничения и перспективы.
ГИБ определяются как бактерии, обладающие способностью эффективно экспрессировать гетерологичные белки или молекулярные соединения для конкретной цели после генной инженерии. Еще в 19 веке Коли выявил терапевтический эффект инактивированных бактериальных смесей при лечении саркомы (Coley, 1893). К концу 20-го века методы генной инженерии стали широко использоваться для модификации бактерий с целью получения ожидаемых соединений.
После десятилетий усилий были созданы многочисленные ГИБ для различных применений в пищевой промышленности, лечении заболеваний, химическом синтезе, защите окружающей среды и т.д. В частности, E. coli, Lactobacillus, Salmonella - наиболее популярные бактерии, используемые в качестве шасси для конструирования различных ГИБ. Такие виды бактерий, как Bifidobacterium, Bacillus subtilis, Listeria monocytogenes и Lactobacillus brevis CD2, используются в здравоохранении и научных исследованиях (см.рис.).
Преимущества ГИБ в управлении заболеваниями
На сегодняшний день ГИБ добились больших успехов в лечении различных заболеваний, таких как инфекционные заболевания, диарея, связанная с приемом антибиотиков, аллергия и метаболические синдромы, в здравоохранении для повседневной жизни. Важно отметить, что ГИБ обладают более системным и комплексным терапевтическим эффектом, чем традиционные методы профилактики и лечения некоторых заболеваний, отчасти потому, что колонизированные микроорганизмы в организме почти равны крошечным живым фабрикам, которые могут автономно воспроизводиться, обнаруживать аномальный гомеостаз, производить терапевтические агенты и инициировать самоуничтожение в определенное время.
Соответственно, ГИБ имеют многообещающий потенциал для использования на разных стадиях заболевания в различных целях. Генно-инженерные бактериальные вакцины, такие как Salmonella, Vibrio cholera, Listeria и Neisseria meningitidis, способны активировать защитные иммунные реакции in vivo путем введения некоторых эффективных антигенов в бактерии с низкой или нулевой вирулентностью.
На примере холеры пероральное введение аттенуированного Haiti V кроликам эффективно сдерживало колонизацию дикого вибриона холеры в тонком кишечнике, тем самым снижая заболеваемость холерной инфекцией. Кроме того, генно-инженерным Lactobacillus удалось обнаружить Vibrio cholerae в образцах стула благодаря специфическому явлению "кворум зондирования" у патогенных микроорганизмов.
В терапии рака некоторые бактерии, такие как Salmonella, Clostridium novyi-NT и E. coli, обладают особой способностью колонизировать солидные опухоли, что позволяет им быть отличными кандидатами для доставки лекарственных препаратов и их производства. Например, S. typhimurium, экспрессирующие трансформирующий фактор роста альфа-псевдомонадный экзотоксин, оказывали значительное ингибирующее действие на рост солидных опухолей CT26, MC38 и 4 T1. При терапии меланомы рекомбинантный S. typhimurium, трансфицированный плазмидой с геном интерферона-гамма, интегрированным в N-концевую область поверхностного иммуногенного белка, продемонстрировал очевидную токсичность для раковых клеток. Кроме того, S. typhimurium, нагруженные CpG ODN и PD-1-siRNA, индуцировали врожденный иммунитет и подавляли экспрессию PD-1, тем самым убивая раковые клетки.
На сегодняшний день широко используемые ГИБ в основном предназначены для лечения некоторых кишечных заболеваний, таких как воспалительные заболевания кишечника (ВЗК) и холера. Например, Lactobacillus, трансфицированные антагонистом рецептора интерлейкина 1, были способны уменьшать количество CD4+ IL-17A+ клеток в мезентериальных лимфатических узлах и блокировать IL-1-клеточную сигнализацию, облегчая тем самым симптомы острого колита; E. coli Nissle 1917 (EcN) с экспрессией холерного аутоиндуктора 1 может сдерживать экспрессию генов вирулентности Vibrio cholera и, таким образом, уменьшать их колонизацию в кишечнике.
По сути, преимущества ГИБ можно кратко сформулировать следующим образом:
- снижение затрат на здравоохранение из-за масштабирования производства и долгосрочного действия ГИБ в местах колонизации;
- снижение побочных эффектов, особенно при пероральном применении;
- для структурно нестабильных или экологически чувствительных соединений - отсутствие необходимости в очистке лекарственных средств и низкотемпературном хранении.
Примечательно, что ГИБ могут производить несколько чужеродных белков или соединений в одном штамме, вместо того чтобы требовать несколько препаратов для достижения синергетического эффекта.
Микробная генетическая инженерия
Микробная генная инженерия использует инструменты генетических операций для сдвига, сращивания и интеграции целевых генов, а затем вводит их в клетки-шасси. Таким образом, рекомбинантные гены переходят в желаемые продукты или наделяют бактерии новыми фенотипами. Благодаря большому прогрессу в технологиях секвенирования и биоинформатике, растет количество функциональных генов и кластеров генов из некультивируемых микроорганизмов. Как экспрессировать функциональные гены или кластеры генов в клетке-шасси становится новой горячей областью исследований в изучении ГИБ.
Действительно, создание ГИБ в основном включает в себя следующие два этапа: восходящий (приобретение функциональных генов) и нисходящий (гетерогенная экспрессия). Приобретение целевых генов или больших кластеров генов является важной частью восходящего этапа при конструировании ожидаемого ГИБ. Благодаря национальным проектам по геному микроорганизмов, запущенным во многих странах, существует множество потенциальных генов, которые можно использовать для изготовления различных ГИБ.
Когда размер гена превышает 50 кб (килобаз), некоторые методы рекомбинации, такие как CRISPR-Cas9 и система рекомбинации Red/ET, являются оптимальными методами для изменения, замены, удаления или добавления оснований или фрагментов генов плазмид или геномов. В частности, CRISPR-Cas9 может редактировать фрагменты бактериальной ДНК размером до 100 кб за один шаг, в ходе которого РНК-направляемая нуклеаза Cas9 нацеливается на фрагменты ДНК и расщепляет их, а конечные крупные фрагменты генов собираются с помощью сборки Гибсона.
Клонирование целевых генов или кластеров генов в бактериальное шасси включает перенос генов и генетическую рекомбинацию с использованием методов трансфекции, трансдукции, конъюгативного переноса, лизогенной конверсии и слияния протопластов. Размер ДНК и свойства бактериального шасси определяют методы переноса. Трансфекция тепловым шоком и электропорация широко используются для переноса плазмид в E. coli, Salmonella, Bacillus thuringiensis, Pseudomonas aeruginosa и др.
Конъюгативный перенос и слияние протопластов часто связаны с переносом плазмид от бактерий-доноров к бактериям-реципиентам. Например, конъюгативная система секреции IV типа синергична с механизмом обработки ДНК, называемым "релаксосомой", а большая внеклеточная трубка, называемая "пилусом", способна организовывать направленный конъюгативный перенос плазмид. Кроме того, технологии гомологичной рекомбинации, в основном включающие гомологичную рекомбинацию, сайт-специфическую рекомбинацию, транспозиционную рекомбинацию и метод CRISPR-Cas9, позволяют напрямую интегрировать целевые гены в хромосому хозяина в соответствующем штамме.
Типичные методы гомологичной рекомбинации требуют более 1 кб гомологичных последовательностей для осуществления рекомбинации целевых генов в хромосомный геном. Благодаря технологии CRISPR-Cas9 работа с ДНК стала гораздо более эффективной и точной, что значительно облегчает выделение и гетерологичную экспрессию кластеров генов в клетках шасси, особенно тех, размер которых превышает 50 кб. Транспозиция и гомологичная рекомбинация также доступны для интеграции экзогенных фрагментов ДНК в бактериальный геном. Примечательно, что когда маркеры отбора или аллели редактирования CRISPR неприменимы, транспозиция является оптимальным выбором для интеграции целевых генов в бактериальный геном. Однако эффективность транспозиции несколько снижается по мере увеличения размера вставляемых фрагментов ДНК.
Однако несущая способность плазмиды и метод транспозиции не позволяют оперировать большими фрагментами ДНК, особенно если их размер превышает 100 кб. Для достижения гетерологичной экспрессии больших кластеров генов исследователи больше склоняются к использованию трансформационно-ассоциированной рекомбинации, бактериальных искусственных хромосом, системы фаговой рекомбинации или системы рекомбинации, опосредованной интегразой.
Хотя вставка чужеродных генов в геном более сложна, чем система экспрессии на основе плазмид, она обладает несравненной стабильностью. В совокупности эти методы, такие как выделение ДНК, сайт-специфическая мутация, вставка генов, удаление генов и трансфекция ДНК, способны удовлетворить большинство генетических манипуляций при создании ГИБ, даже если их размер превышает 100 кб. Однако создание ГИБ для надежной и эффективной экспрессии чужеродных белков или соединений все еще представляет собой серьезную проблему, главным образом потому, что межвидовые различия не позволяют микробному шасси экспрессировать большинство чужеродных генов или кластеров генов даже после оптимизации кодонов.
Таким образом, основное противоречие создания ГИБ заключается в том, что секвенирование генов выявляет все большее количество функциональных генов или кластеров генов из некультивируемых микроорганизмов, характеризующихся длительным циклом роста или жесткой культурой, но недостаточно микробных шасси для их экспрессии или доставки для диагностики и лечения заболеваний.
Доклиническое и клиническое применение ГИБ в лечении заболеваний
Еще 100 лет назад бактерии использовались для лечения опухолей и клостридиального энтерита. Инженерные бактерии на начальных этапах в основном были направлены на лечение воспаления желудочно-кишечного тракта и опухолей. Достижения в области генетических технологий наделили ГИБ большим количеством функций и широкими перспективами применения. Альтернативным методом является доставка чужеродных терапевтических препаратов, что позволяет смягчить недостатки природных препаратов, связанные с низким уровнем производства, коротким временем действия и свойством неорального введения. В этом разделе мы подробно описываем применение ГИБ для лечения множества заболеваний, таких как ВЗК, ожирение, диабет и рак.
Желудочно-кишечные заболевания
Дисрегуляция кишечных микроорганизмов вызывает желудочно-кишечные заболевания и, в некоторых случаях, повреждает нормальные органы через ось ткань-кишечник. Рутинное добавление пробиотиков успешно улучшает или лечит такие заболевания, как острая диарея, ВЗК и диабет. ВЗК имеют высокую распространенность во всем мире, но до сих пор не существует эффективного метода лечения. Учитывая ключевую роль микроорганизмов в микроэкологическом балансе кишечника и воспалительные характеристики ВЗК, противовоспалительный цитокин, интерлейкин-10, был экспрессирован в Lactobacillus для лечения хронического заболевания, что в итоге привело к 50% терапевтической эффективности в мышиной модели ВЗК.
Аналогичным образом, интерлейкин-4 (IL-4), экспрессирующийся Lactobacillus, также значительно облегчал воспалительную реакцию, вызванную повышенным количеством Th1-клеток. Кроме того, пероральное введение интерлейкина-35 (IL-35), экспрессирующегося E. coli, очевидно, ослабляло воспалительное повреждение в тканях толстой кишки мышей, тем самым улучшая симптомы ВЗК.
Эластин обычно используется для лечения ВЗК из-за его ингибирующего влияния на активность сериновых протеаз и противовоспалительного эффекта. Пероральный прием штаммов Lactobacillus, экспрессирующих эластин, оказал сильное ингибирующее действие на декстран сульфат натрия, вызывающий ВЗК. Аналогичным образом, генетически модифицированные штаммы Lactobacillus могли использовать слизистую для доставки противовоспалительной молекулы, рекомбинантной мышиной гемоксигеназы-1, и таким образом снизить частоту возникновения острого колита. Помимо ВЗК, ГИБ использовались для экспрессии чужеродных белков, таких как антибактериальный белок, ассоциированный с панкреатитом, для облегчения или лечения вызванных химиотерапией кишечных заболеваний и мукозита у мышей.
Рак
Специфическое микроокружение опухоли позволяет колонизировать факультативно-анаэробные или анаэробные бактерии в гипоксических областях солидных опухолей. Использование опухоль-таргетных бактерий, таких как Bifidobacterium, Salmonella, Clostridium novyi-NT и E. coli, для доставки различных белков, химических молекул, преферментов и т.д. для лечения рака, в совокупности называют бактериолитической терапией, но подробное описание всех противораковых ГИБ выходит за рамки данного обзора.
Метаболические заболевания
Растущая распространенность ожирения, диабета и других метаболических заболеваний в современном обществе ложится тяжелым бременем на медицину. Эти метаболические заболевания обычно характеризуются гипергликемией, гиперлипидемией и повышением уровня липопротеинов высокой плотности, и одновременно они могут провоцировать друг друга. Примечательно, что большинство пациентов с метаболическими заболеваниями должны принимать лекарства до конца жизни, чтобы облегчить или замедлить прогрессирование заболевания. В отличие от этого, пероральный прием ГИБ имеет мало побочных эффектов и лучше принимается. Действительно, многие ГИБ уже созданы и оценены для лечения врожденных или приобретенных метаболических заболеваний.
Диабет
Диабет является одной из самых серьезных проблем здравоохранения во всем мире и несет существенное бремя для социально-экономического развития планеты. Клинически диабет подразделяется на диабет 1 типа (T1D) и диабет 2 типа (T2D). Многочисленные исследования показали, что прогрессирование заболевания при Т2Д тесно связано с дисбалансом микрофлоры кишечника. Поэтому регулирование микроокружения кишечника с помощью пробиотиков или ГИБ может стать альтернативной стратегией лечения или замедления развития диабета, особенно Т2Д.
Учитывая механизмы, лежащие в основе диабета, лечение может быть достигнуто путем использования сконструированных бактерий для производства белков с гипогликемическим эффектом. Например, глюкагоноподобный пептид 1 (GLP-1) является эффективным препаратом для лечения диабета, но его короткий период полураспада и высокая стоимость препятствуют его широкому клиническому применению. Однако ГИБ, характеризующиеся колонизацией кишечника, имеют потенциал для решения вышеуказанных проблем. Используя GLP-1, обладающий способностью переводить эпителиальные клетки кишечника в клетки, секретирующие инсулин, GLP-1-экспрессирующие Lactobacillus успешно нормализовали уровень глюкозы в крови у диабетических крыс. Другие белки или соединения против диабета также могут достичь аналогичного терапевтического эффекта, используя пробиотики в качестве векторов доставки. Например, рекомбинантные Lactobacillus, экспрессирующие белок теплового шока 65 и IA2P2 (пептид из 23 аминокислот), эффективно облегчали симптомы панкреатита и улучшали течение диабета, подавляя антиген-специфическую пролиферацию Т-клеток при Т1Д и регулируя баланс между Th17/Tregs и Th1/Th2 клетками.
Ожирение
Ожирение - сложное многофакторное заболевание и ключевой фактор развития других хронических заболеваний, таких как сердечно-сосудистые заболевания, рак и диабет. Как правило, ожирение встречается у людей среднего и пожилого возраста. Все больше сообщений показывают, что распространенность ожирения у детей и подростков в возрасте от 2 до 19 лет постепенно растет во всем мире, особенно в развитых странах. Большинство традиционных препаратов против ожирения, таких как сибутрамин и орлистат, действуют путем подавления аппетита или блокирования поглощения жира в организме, но они производят очевидные неблагоприятные эффекты на нормальные физиологические функции.
К счастью, в ряде исследований были разработаны ГИБ, экспрессирующие факторы, препятствующие ожирению, для борьбы с ним. Например, GLP-1-экспрессирующие Lactobacillus могут снизить частоту ожирения у мышей, вызванного высокожировой диетой, сдерживая накопление липидов, повышая устойчивость GLP-1 к непереносимости глюкозы и увеличивая экспрессию генов, участвующих в пути деградации триглицеридов. Кроме того, Bacillus subtilis SCK6 использовал ацетат трансферазу коэнзима А для увеличения производства масляной кислоты и стимуляции пути киназы масляной кислоты, тем самым ослабляя стеатоз печени и накопление жира у мышей, получавших диету с высоким содержанием жира. Аналогичным образом, Lactobacillus reuteri, экспрессирующий интерлейкин-22 (IL-22), явно снижал частоту развития неалкогольной жировой болезни печени у мышей, получавших диету с высоким содержанием жира.
Гипераммонемия, фенилкетонурия и другие метаболические заболевания
Гипераммонемия, как метаболическое заболевание, обозначает пациентов с высоким уровнем аммиака в плазме крови (>50 мкмоль/л у взрослых и >100 мкмоль/л в неонатальный период). В нормальных условиях аммиак в основном вырабатывается в кишечнике и выводится печенью, но тяжелые метаболические нарушения, вероятно, вызывают массивное накопление аммиака в организме и, таким образом, влияют на цикл мочевины и могут даже вызвать печеночную энцефалопатию. Современные стратегии лечения пациентов с гипераммониемией включают гемодиализ, перитонеальный диализ и антибиотикотерапию. Однако эти методы лечения значительно повышают вероятность инфекции и приводят к развитию лекарственной резистентности.
Однако пероральное применение пробиотиков может значительно снизить уровень аммиака у мышей с печеночной энцефалопатией, что демонстрирует возможность создания ГИБ для лечения гипераммониемии. Кроме того, удалив негативный регулятор синтеза I-аргинина и добавив устойчивый к обратной связи фермент биосинтеза I-аргинина в EcN, ГИБ успешно добились преобразования NH3 в I-аргинин в бактериях, тем самым блокируя накопление аммиака in vivo и замедляя прогрессирование гипераммониемии.
Фенилкетонурия - это аутосомно-рецессивное генетическое заболевание, характеризующееся задержкой умственного развития и роста. Фенилкетонурия возникает в результате дефицита гена гидроксилов фенилаланина, что препятствует превращению фенилаланина в тирозин. Методы лечения фенилкетонурии включают ограничения в питании, генную терапию и замену ферментов. Однако даже хорошо контролируемая диета не может полностью предотвратить возникновение психических проблем у пациентов с фенилкетонурией, генная терапия является чрезвычайно дорогостоящей, а заместительная терапия ферментами явно зависит от дозы препарата и графика приема.
Однако пробиотики потенциально могут быть модифицированы для производства дефицитных фенилаланингидроксильных ферментов в дополнение к физиологическим потребностям. Вставка генов фенилаланин-аммоний-лиазы и деаминазы L-аминокислот в геном EcN позволяет пробиотикам преобразовывать фенилаланин в соль транс-коричной кислоты в желудочно-кишечном тракте, что приводит к снижению содержания фенилаланина в крови при пероральном приеме на 38%.
Артериальная гипертензия - распространенное хроническое заболевание, которое является не только основной причиной сердечно-сосудистых заболеваний, но и повреждает мозг, почки и другие органы. Для лечения гипертонии было разработано множество терапевтических средств, включая β-блокаторы, блокаторы кальциевых каналов, диуретики и ингибиторы ренин-ангиотензинконвертирующего фермента. Однако длительное применение этих антигипертензивных препаратов часто приводит к потенциальным побочным эффектам, таким как повреждение артерий, ангионевротический отек, аритмии, импотенция, гиперкалиемия и сильный кашель. Более того, некоторые препараты, такие как ингибирующие ангиотензин-конвертирующий фермент пептиды, требуют больших доз для оказания терапевтического эффекта, поскольку их активность склонна подавляться другими ферментами.
Тем не менее, пробиотики, сконструированные для экспрессии фермента, способны решить эту проблему. Например, введение в Lactobacillus plantarum NC8 генов, кодирующих каркасный белок тунца и каркасный белок желтоперых рыб, позволило пробиотику синтезировать ингибирующие ангиотензин-превращающий фермент пептиды, а пероральное введение ингибирующих ангиотензин-превращающий фермент пептидов значительно снижало систолическое артериальное давление и уровень триглицеридов в модели гипертензивных мышей, демонстрируя хорошую антигипертензивную способность.
Заключение и перспективы
Микроорганизмы вовлечены практически во все фундаментальные процессы физиологического гомеостаза. Одним из примеров все более важной роли бактериотерапии является регуляция кишечной флоры для лечения кишечных заболеваний и адъювантной терапии других заболеваний, таких как рак и метаболические заболевания. Примечательно, что прогресс в технологиях секвенирования генов частично раскрыл тайны человеческих микробов и взаимодействия между ними и различными клетками млекопитающих, что значительно продвинуло доклинические исследования ГИБ. На сегодняшний день большинство существующих терапевтических ГИБ были модифицированы из пробиотиков кишечника человека, что демонстрирует их потенциальную безопасность по сравнению с традиционными химическими препаратами, особенно при длительном применении. ГИБ являются не только эффективными терапевтическими агентами против хронических заболеваний благодаря своей способности колонизации кишечника, но и расширяют сферу применения таргетного лечения опухолей.
Использование инженерных бактерий в лечении заболеваний все еще находится на начальной стадии и имеет ограничения для неизлечимых заболеваний. Кроме того, клиническому применению ГИБ все еще препятствуют потенциальная патогенность и местные законы и нормы, которые позволяют проводить клинические испытания только с использованием бактерий без каких-либо генетических модификаций.
В будущем предстоит определить,
- могут ли генетически вставленные гены ГИБ распространяться в геномы других бактерий или клеток млекопитающих;
- как ГИБ могут стабильно колонизировать и производить ожидаемые субстраты в целевых местах;
- как они взаимодействуют с кишечной флорой, нормализуя тем самым состояние здоровья;
- и как зафиксировать их в ожидаемых тканях и удалить их после того, как они выполнят свою миссию.
Такие вопросы подчеркивают важность изучения генетической стабильности генов, вставленных в ГИБ, в нормальных физиологических условиях. Однако по мере развития биологических технологий новые доступные бактериальные инструменты и усовершенствование терапевтических стратегий ГИБ еще больше снимут потенциальные проблемы безопасности и увеличат глубину и широту их применения в профилактике и лечении заболеваний.
В совокупности, учитывая важность микробиоты для нормального физиологического функционирования, давнее использование пробиотиков и продуктов, полученных из бактерий, для поддержания здоровья, а также наше все более глубокое понимание механизмов, лежащих в основе различных взаимосвязей между кишечником и мозгом, мы ожидаем, что ГИБ внесут важный вклад в профилактику и лечение различных заболеваний, с которыми существующие препараты не могут справиться или вызывают серьезные побочные эффекты.
