Несмотря на огромные успехи в области лечения инфекционных заболеваний, иммуномодулирующие стратегии, направленные на укрепление иммунитета хозяина (основной фактор, определяющий исход заболевания), по-прежнему остаются неудовлетворенной потребностью.
Для того чтобы добиться успеха, эти меры должны быть широко применимы в профилактических и терапевтических целях, стимулировать иммунную защиту против множества патогенов и использовать локальное усиление иммунной защиты в месте инфекции независимо от наличия цитопении и/или базовой иммунной дисфункции. Начало иммунотерапии восходит к XIX веку, когда в опухоли вводили бактерии и бактериальные токсины, чтобы стимулировать иммунитет хозяина против злокачественных опухолей, а в доантибиотическую эпоху - сывороточную терапию, способствующую опсонизации, нейтрализации токсинов и/или запуску опосредованного комплементом лизиса бактерий.
За последнее столетие иммунотерапия развилась до высокоинженерных классов терапевтических средств со специфическими механизмами иммунной модуляции. Иммуноинженерия - применение инженерных принципов для разработки иммунотерапевтических препаратов - совершает революцию в лечении рака. Так, химерные антигенные рецепторы (CAR) Т-клеточной терапии и инженерия антител, улучшили выживаемость пациентов при раке, устойчивом к другим методам лечения.
В то время как прорывы в области иммуноинженерии изменили результаты лечения рака, область инфекционных заболеваний сталкивается с беспрецедентными проблемами. Глобальные пандемии, резистентность к противомикробным препаратам и изменение климата - все это способствует росту числа инфекций, вызываемых новыми патогенами. В качестве потенциального средства борьбы с этими проблемами инженерная иммунотерапия обладает рядом привлекательных особенностей по сравнению с традиционной терапией антимикробными препаратами, а именно:
(1) иммунные клетки обладают множеством антимикробных активностей, а не одним механизмом действия;
(2) иммунные клетки активны против некоторых инфекций, для которых не существует эффективных лекарств (например, аденовирусная инфекция); и
(3) адаптивная иммунная система способна генерировать память, позволяющую осуществлять постоянный контроль против рецидивов и реинфекций.
За последнее десятилетие достижения в области клеточной инженерии, биоматериалов и фундаментальное понимание иммунных механизмов, включая активацию и истощение, послужили толчком к революции в иммуноинженерии. Данный обзор представляет собой введение в концепции иммуноинженерии для аудитории, изучающей инфекционные заболевания, с использованием исторических и недавних примеров технологий, не уделяя большого внимания техническим деталям. Иммуноинженерия подразделяется на 3 области: клеточная инженерия, сигнальная инженерия и инженерия микроокружения.
Иммунная клеточная инженерия
Прямая доставка иммунных клеток для лечения или профилактики инфекций особенно привлекательна для пациентов с ослабленным иммунитетом и специфическим иммунодефицитом. Первые клинические испытания в этой области включали забор гранулоцитов у здоровых доноров для лечения пациентов, страдающих от тяжелых инфекций в условиях нейтропении. Перед забором крови здоровые доноры проходят курс лечения гранулоцитстимулирующими препаратами, чтобы повысить количество нейтрофилов. Затем гранулоциты выделяют и переливают нейтропеническим пациентам с инфекциями. Эти клинические испытания имели ограниченный успех, возможно, из-за трудностей с получением высоких доз и недолговечности взрослых нейтрофилов. В настоящее время предпринимаются усилия по созданию иммортализованных предшественников нейтрофилов и они успешно используются для лечения животных в доклинических моделях кандидемии и аспергиллеза легких.
В отличие от гранулоцитов, Т-клетки живут дольше и ими легче манипулировать. При адоптивном переносе клеток Т-клетки могут быть отобраны на основе антигенной специфичности ex vivo, наращены, а затем доставлены обратно тому же пациенту или в ходе аллогенной трансплантации. В клиническом испытании фазы 1 для пациентов, получающих аллогенную трансплантацию костного мозга, цитотоксические CD8-клетки, специфичные к цитомегаловирусу (CMV), были размножены ex vivo и доставлены в виде 4 еженедельных доз 14 пациентам.
Для получения и расширения поликлональных CD8 T-клеток мононуклеарные клетки периферической крови доноров культивировали с аутологичными фибробластами, инфицированными CMV, с персистенцией в течение 7-14 дней при обнаружении CMV-специфической цитолитической активности. Затем культура подвергалась циклической стимуляции и пролиферации интерлейкином 2 и CMV-инфицированными фибробластами с окончательной сортировкой для получения CD3+/CD8+/CD4-цитотоксических лимфоцитов для лечения пациентов. Ни у одного из пациентов, прошедших лечение, не развилась ДНКемия CMV или заболевание в течение первых 100 дней после трансплантации.
Адоптивный перенос клеток также успешно использовался для лечения лимфопролиферативного заболевания, вызванного вирусом Эпштейна-Барр (EBV), когда Т-клетки были получены от доноров с повышенным титром вирусного капсидного антигена без другой специфической антигенной селекции. Среди 5 пациентов, прошедших лечение, у всех был полный патологический или клинический ответ - двое умерли от дыхательной недостаточности, которая, как считается, не была связана с EBV или адоптивным переносом клеток, а у остальных трех пациентов наблюдалась устойчивая ремиссия в течение 10-16 месяцев к концу отчетного периода наблюдения. У здоровых доноров были обнаружены популяции Т-клеток, обладающие мультивалентной эффективностью против вирусов с двухцепочечной ДНК, включая EBV, CMV, аденовирус и BK-полиомавирус; при поиске подходящих по антигену лейкоцитов человека (HLA) реципиентов они изучаются в качестве возможной готовой терапии.
В конечном итоге адоптивный перенос клеток без дальнейшей клеточной инженерии ограничен из-за необходимости подбора HLA-реципиентов. Кроме того, для экспансии необходимо определить конкретный клон. Технология CAR позволяет создавать индивидуальные Т-клеточные рецепторы, которые могут быть введены в аутологичные иммунные клетки пациента. Благодаря достижениям генетики и синтетической биологии (особенно при вирусной доставке генов), иммунные клетки могут быть сконструированы и перепрограммированы на конкретные цели. Эти сконструированные клетки могут быть культивированы ex vivo до доставки и могут приживаться и пролиферировать in vivo, а также формировать клетки памяти для постоянного иммунного контроля против выбранного антигена.
Наиболее масштабные исследования CAR T-клеток в инфекционной сфере были посвящены борьбе с вирусами. Было проведено несколько клинических испытаний по оценке безопасности CAR T-клеток, созданных против вируса иммунодефицита человека (ВИЧ). CAR были разработаны для связывания с оболочечным гликопротеином-120 или на основе широко нейтрализующих антител. В одном из передовых подходов CAR T-клетки также были подвергнуты манипуляциям, направленным на снижение экспрессии генов иммунного истощения PD-1, TIM-3 и LAG-3. Хотя некоторые из этих подходов позволили уменьшить вирусный резервуар, они не смогли надолго предотвратить вирусную рецидивную инфекцию, когда пациенты прекратили прием антиретровирусных препаратов.
Одна из гипотез заключается в том, что при низкой антигенемии ВИЧ на фоне приема антиретровирусных препаратов активация и персистенция CAR T-клеток ограничены. Чтобы преодолеть эту проблему, были сконструированы CMV/HIV-специфические CAR T-клетки, нацеленные на область V5 оболочки ВИЧ через домен N6 широко нейтрализующих антител. Гуманизированные мыши, инфицированные ВИЧ, были успешно вылечены с помощью CMV/HIV-специфических CAR T-клеток со стимуляцией посредством инъекции антигена CMV pp65 (белок оболочки); однако пока неясно, будет ли эта стратегия клинически эффективной.
В то время как большинство испытаний CAR для борьбы с инфекцией было направлено против ВИЧ-инфекции, недавно завершилось испытание 3-й фазы аллогенной CAR T-клеточной терапии EBV-позитивного посттрансплантационного лимфопролиферативного заболевания. Хотя вирус гепатита В (HBV) не поддается лечению обычными противовирусными препаратами, CAR Т-клетки против антигенов HBV излечили гуманизированных мышей с HBV. В настоящее время ведутся работы по лечению CMV, хотя клетки, инфицированные CMV, могут быть более устойчивы к цитотоксическому Т-клеточному киллингу, чем другие вирусы.
Помимо вирусов, инвазивные грибки являются еще одной основной причиной заболеваемости и смертности среди людей с ослабленным иммунитетом и представляют собой привлекательную мишень для клеточной иммуноинженерии. Aspergillus fumigatus - наиболее распространенный инвазивный грибок, вызывающий заболевания у пациентов с ослабленным иммунитетом. Наша группа и другие исследователи использовали эпитопы, специфичные для гиф A. fumigatus, в качестве антигенов-мишеней для человеческих CAR T-клеток и продемонстрировали эффективность в лечении инвазивного аспергиллеза в иммунокомпрометированных мышиных моделях.
В качестве мишеней для элементов A. fumigatus использовались AB90-E8, консервативный белковый антиген клеточной стенки, грибковые углеводы через связывание с дектином-1 и лиганды моноклонального антитела AF-269-5 с высокой аффинностью к гифам и слабой к конидиям - его точный эпитоп находится в стадии изучения, но предполагается, что это гликопротеин. Мы усовершенствовали предыдущие разработки, создав CAR второго поколения с ко-стимулирующими доменами CD137/4-1BB вместо предыдущего домена CD28, а также используя лентивирус в качестве средства доставки вместо предыдущих попыток использовать оперон Sleeping Beauty. Аналогичным образом, углеводы в клеточной стенке Cryptococcus neoformans были использованы в качестве CAR-мишеней с последующим снижением количества вирулентных клеток дрожжевого грибка в мышиных легких.
В настоящее время CAR Т-клетки и другие клеточно-инженерные технологии для борьбы с бактериальными и паразитарными инфекциями развиты недостаточно. Появляется все больше доказательств того, что слабый иммунный ответ хозяина на некоторые бактериальные инфекции, такие как Staphylococcus aureus, может быть обусловлен доминированием Т-регуляторных клеток в иммунном фенотипе хозяина и индуцированием толерантности. Стафилококк также может перехватывать PD-1 для подавления активности Т-клеток. Теоретически CAR T-клетки могут быть сконструированы против S. aureus и преодолеть эти препятствия, используя антистафилококковые Th17 CD4 CAR T-клетки и блокируя PD-1 либо путем конструирования T-клеток, либо с помощью дополнительного лечения ингибиторами контрольных точек, но это еще предстоит выяснить.
Еще одним направлением развития клеточной инженерии CAR является терапия натуральными киллерами (NK) CAR, когда цитотоксическая функция NK-клеток перенаправляется против различных вирусных инфекций. Помимо разработки моновалентных CAR против конкретных патогенов, будущая работа в области CAR-клеточной терапии инфекционных заболеваний включает разработку плюрипотентных CAR T-клеток (например, с активностью против нескольких патогенов), улучшение продолжительности их действия в тканях и, что еще более важно, совершенствование конвейера производства клеток для создания более «готовых» терапий, способствующих экономически эффективной клинической трансляции. Еще одной проблемой клинического применения CAR является токсичность, которая довольно часто встречается при использовании CAR T-клеточной терапии для лечения злокачественных опухолей.
Инженерия иммунных сигналов
Клеточная инженерия очень сложна, ее трудно масштабировать и она сопряжена с большими препятствиями в области регулирования. Доставка небольших сигнальных молекул, таких как цитокины или мессенджерные РНК (мРНК), приводящие к выработке антигенов, может стимулировать специфическое иммунное поведение хозяина in situ и не требует больших затрат на производство и цепочку поставок. Достижения в области иммунологии привели к лучшему пониманию сигнальных путей иммунных клеток. Эти фундаментальные знания могут быть использованы иммуноинженерами для точной доставки этих сигналов в биологические системы. Разрабатывая технологии, позволяющие точно передавать сигналы, можно совершать новые фундаментальные открытия и продолжать инновации в иммуноинженерии. Чтобы проиллюстрировать принципы, которые позволили улучшить доставку иммунных сигналов, мы обсудим два исторических примера в иммуноинженерии против инфекционных заболеваний: разработку интерферона альфа (IFN-α) против вируса гепатита С (HCV) и создание эффективных мРНК-вакцин против коронавируса 2 тяжелого острого респираторного синдрома (SARS-CoV-2).
До конца 1980-х годов не существовало эффективных методов лечения HCV. Иммунотерапия экзогенными интерферонами, семейством цитокинов, вырабатываемых преимущественно иммунными клетками хозяина, приводила к излечению примерно у 5% пациентов. Однако интерфероны имеют короткий период полураспада - всего несколько часов, и для достижения эффективности требуется делать инъекции не менее трех раз в неделю. Инженеры по биоматериалам разрабатывали методы модификации белков для снижения иммуногенности и увеличения периода полураспада с 1960-х годов. Полиэтиленгликоль или ПЭГ, - это гидрофильный полимер, который может быть химически конъюгирован с молекулами, в том числе с молекулами рекомбинантных белков, в процессе, называемом ПЭГилированием. За счет увеличения количества повторяющихся звеньев в полимерной цепи ПЭГ (что отражается в молекулярной массе полимера) почечный клиренс ПЭГ задерживается, а время циркуляции увеличивается. ПЭГилирование ИФН-α увеличило период полувыведения с 5 до 77 часов, а ранние клинические испытания показали, что устойчивое излечение от HCV увеличилось с 5 до 36%. ПЭГилированный ИФН-α комбинировали с рибавирином для дальнейшего повышения эффективности; в итоге были открыты эффективные противовирусные препараты против HCV, что привело к излечению на уровне >97%.
Иммуноинженерия с использованием ПЭГилирования имеет и другие клинические применения. В 2019 году SARS-CoV-2 вызвал глобальную пандемию COVID-19, что привело к 7 миллионам смертей. В результате сотрудничества между научными и промышленными кругами была разработана мРНК, кодирующая белок спайка в качестве антигена. Однако мРНК, доставляемые системно, быстро разрушаются и не могут преодолеть плазменные мембраны клеток. Для доставки нуклеиновых кислот в клетки биомедицинские инженеры в 1970-х годах начали разрабатывать биоразлагаемые полимерные средства доставки. К моменту пандемии COVID-19 иммуноинженеры создали сложные средства доставки липидных наночастиц для оптимальной доставки мРНК. Эти липидные наночастицы являются катионными для образования комплексов с отрицательно заряженной мРНК, содержат ПЭГилированные липиды для увеличения циркуляции и снижения опсонизации/очищения хозяина, а также соединяются с мембранами клеток хозяина для доставки груза мРНК. По предварительным оценкам, вакцины COVID-19 спасли около 1,5-1,7 миллиона жизней. Иммуноинженерия и другие развивающиеся области, такие как тканевая инженерия, внесли дополнительный вклад в наше понимание вирусных пандемий, разработав новые платформы in vitro для поиска лекарственных препаратов.
По мере углубления нашего понимания иммунных сигнальных путей будут появляться новые области, которые созреют для иммуноинженерии. Например, ингибиторы контрольных точек произвели революцию в лечении метастатической меланомы, рака молочной железы и других злокачественных опухолей. Сепсис и тяжелые грибковые инфекции также повышают регуляцию чекпойнтовых путей, что может привести к неадекватному подавлению иммунитета. Имеется несколько сообщений о лечении инвазивных грибковых заболеваний с помощью адъювантной терапии ингибиторами контрольных точек, что согласуется с результатами доклинических исследований, продемонстрировавших их эффективность на мышах с грибковой пневмонией. Неправильное количество ингибиторов контрольных точек может привести к побочным явлениям, связанным с иммунитетом, и усугубить инфекцию; будущие работы в области иммуноинженерии могут найти «золотую середину» оптимальной дозы, идеальной кинетики доставки и тканевого таргетинга для оптимальной доставки ингибиторов контрольных точек при инфекциях.
Инженерия иммунного окружения
В некоторых сценариях одной только подачи сигналов недостаточно, чтобы вызвать желаемый и устойчивый иммунофенотип. Подача сигналов в контексте микроокружения может дополнительно обеспечить важные сигналы для иммунных клеток, такие как биомеханический контекст и дополнительная пространственная/временная информация. Вместо того чтобы вводить вакцины в виде жидких болюсов, иммуноинженеры начали доставлять компоненты вакцин в имплантируемые системы скаффолдов, где антиген и адъювант могут быть доставлены к антигенпрезентирующим клеткам (АПК) в определенном микроокружении для стимулирования иммунитета.
Вакцинные платформы на основе биоматериалов обладают рядом ключевых преимуществ перед традиционными болюсными вакцинами, включая:
(1) контроль над временной кинетикой воздействия антигена;
(2) создание микросреды, оптимизированной для активации АПК;
(3) способность механически презентировать антигены особым образом; и
(4) дополнительный адъювантный эффект самого биоматериала.
Острая инфекция обычно приводит к быстрому притоку антигенов в течение 1-2 недель, пока патоген размножается, а затем, в конце концов, очищается иммунной системой хозяина. Однако традиционные болюсные вакцины приводят к воздействию антигена в течение 1-2 дней до его удаления. Контролируемая и длительная доставка антигена/адъювантных компонентов из систем биоматериалов может имитировать естественную временную экспозицию антигенов во время острой инфекции.
В одном из примеров инъекционный гидрогель, содержащий полимерные наночастицы, был загружен модельным антигеном (овальбумином) и агонистом Toll-подобного рецептора (TLR) 3 в качестве адъюванта для измерения эффекта доставки скаффолда в мышиной модели. Эта система разлагается в течение нескольких недель, что позволяет проводить длительную иммунную стимуляцию. По сравнению с болюсным введением, скаффолды приводили к повышению титра антител, привлечению большего количества АПК и большему количеству антиген-специфических В-клеток в лимфатических узлах.
Платформы для вакцин из биоматериалов также являются мощными, поскольку они могут быть настраиваемыми и модульными - в одной и той же платформе можно использовать различные антигены и комбинации адъювантов. Например, та же система гидрогеля/полимерных наночастиц была оценена с использованием белка-шипа SARS-CoV-2 с CpG (агонист TLR9) и алюмокалиевыми адъювантами и привела к более высоким титрам и большей противовирусной нейтрализации в мышиной модели с последующим анализом вирусной нейтрализации. Кинетика доставки лекарств также может быть изменена путем изменения свойств материала.
Эти стратегии иммуноинженерии имеют реальные перспективы для доставки иммунотерапии. Например, платформа гидрогель/наночастицы была адаптирована для доставки коммерчески доступной вакцины против бешенства. В мышиной модели однократная доза системы биоматериалов вызвала сопоставимый гуморальный и клеточно-опосредованный антиген-специфический иммунитет по сравнению с болюсным введением и ревакцинацией через 3 недели. В условиях ограниченных ресурсов сокращение числа инъекций и медицинских вмешательств может существенно повлиять на эффективность вакцинации.
Другая иммуноинженерная стратегия создания эффективного микроокружения включает активное привлечение АПК в имплантируемые скаффолды с помощью хемокинов. Например, биодеградируемые полимерные трехмерные скаффолды, синтезированные из полимолочной кислоты, были загружены антигеном кишечной палочки, адъювантом CpG и гранулоцит-макрофагальным колониестимулирующим фактором (GM-CSF) в качестве хемоаттрактанта. Антиген кишечной палочки был получен путем разработки человеческого опсонина (маннозо-связывающего лектина) с Fc-доменом и связывания его с микробусинами.
Маннозо-связывающий лектин (MBL) играет важную роль во врожденном иммунитете, поскольку он эволюционировал для связывания различных патоген-ассоциированных молекулярных паттернов (PAMPs). При воздействии на микробусины с Fc-доменом MBL убитой кишечной палочкой, PAMPs были собраны и применены в качестве разнообразного пула антигенов внутри полимерного каркаса. GM-CSF высвобождался в течение нескольких недель для привлечения АПК в скаффолд, где было создано микроокружение с высокой концентрацией антигена и адъюванта. В летальной мышиной модели сепсиса, вызванного E coli, мыши, вакцинированные вакциной на биоматериале, выжили в 100% случаев по сравнению с 67% выживаемостью при обычной болюсной вакцинации.
Эта стратегия с использованием скаффолдов и микробусинок с Fc-доменом-MBL была также эффективна при использовании биоразлагаемого кремнезема, а не полимерного скаффолда. PAMPs из убитой кишечной палочки были загружены в инъекционный биоразлагаемый керамический скаффолд с CpG и GM-CSF и предотвратили смертность от сепсиса кишечной палочки у мышей и свиней. Вероятно, благодаря гомологии PAMPs между видами бактерий, вакцинация этим методом с использованием PAMPs E coli обеспечила перекрестную защиту от Enterobacter cloacae. Наша группа также использовала подобную систему скаффолдов, нагруженную PAMPs S. aureus, для уменьшения абсцессов, вызванных S. aureus, и инфекций ортопедической фурнитуры в мышиных моделях.
Создание имплантируемой микросреды для доставки антигенов с пространственным и временным контролем является перспективным новым способом иммунотерапии. Несмотря на то, что современные данные по инфекциям относятся к доклиническим моделям, в настоящее время проводятся клинические испытания по лечению рака с использованием имплантируемых вакцинных скаффолдов. Моделирование тканеспецифической микросреды с помощью иммуноинженерии может позволить вызвать сильный иммунный ответ на специфические антигены, а также сгенерировать более стойкий ответ при меньших дозах по сравнению с традиционными вакцинными технологиями. Эти технологии будут развиваться по мере определения оптимальной дозировки и соотношения антиген/адъювант, а также кинетики высвобождения в контексте конкретных инфекций.
Иммуноинженерия для лечения и профилактики инфекционных заболеваний является развивающейся областью, однако она опирается на исторический успех, что подтверждается клиническими примерами, включая недавнюю вакцину COVID-19 на основе мРНК. В этом обзоре мы выделили несколько основных аспектов трансляционных и клинических исследований при разработке иммуноинженерных стратегий. Манипулируя клетками, сигналами и микросредой, иммуноинженеры продолжают разрабатывать новые терапевтические средства для преодоления современных инфекционных проблем.
