Использование генетической картографии для составления карты клеточных линийИспользование генетической картографии для составления карты клеточных линий
Соединив отслеживание клеточной линии с изучением молекулярной экспрессии генов, исследователи выяснили, как активность генов влияет на производство иммунных клеток.
Гемопоэтические стволовые клетки (ГСК) - это клеточные фабрики, которые производят клетки крови и иммунные клетки, но их производительность значительно варьируется. Эта вариативность влияет на успех терапии по пересадке костного мозга, которая в значительной степени зависит от количества и типа клеток крови при трансплантации донорских ГСК. Хотя экспрессия генов влияет на клеточную линию, механизм регуляции остается неясным.
"Это пример того, как терапевтическое использование опережает наше понимание фундаментального механизма. Клинически доказано, что [ГСК] полезны, поэтому это действительно стимулирует дальнейшие исследования, чтобы лучше понять их регуляцию", - отмечает Ронг Лу, биолог стволовых клеток из Университета Южной Калифорнии. Исследуя регуляцию ГСК для улучшения иммунной регенерации, Лу и ее коллеги выявили ассоциации между активностью генов, которые модулируют разнообразие и количество производимых иммунных клеток. Их результаты, опубликованные в журнале Science Advances, дают представление о том, как отличительные генетические особенности могут улучшить оптимизацию пулов донорских клеток для терапии.
Лу задалась вопросом, являются ли различия между отдельными ГСК врожденными или на них влияет окружающая среда. Чтобы проверить это, исследователи инфицировали ГСК лентивирусами, несущими уникальные генетические штрих-коды для отслеживания отдельных клеток. Этот метод позволил Лу измерить количество и тип клеточной продукции. Лу сосредоточилась на гранулоцитах и В-клетках, которые являются наиболее многочисленными миелоидными и лимфоидными иммунными клетками, соответственно.
В эксперименте по трансплантации они ввели штрих-кодированные клоны ГСК первичной мыши-реципиенту. После извлечения тех же стволовых клеток исследователи пересадили их нескольким другим мышам. Даже если перед трансплантацией проводилась лучевая или химиотерапия, уровень кроветворения у вторичных мышей оставался неизменным; эти результаты свидетельствовали о том, что способность к кроветворению определяется каким-то врожденным фактором. "Основная техническая проблема заключалась в возможности связать отслеживание клеток и их производства с экспрессией генов соответствующих клеток", - рассказывает Лу.
Чтобы ответить на этот вопрос, исследователи измерили клеточный выход генетически отслеживаемых штрих-кодированных ГСК. После использования секвенирования РНК одиночных клеток (scRNA-seq) они пометили отдельные клетки еще одной меткой - клеточным штрих-кодом кДНК. Чтобы связать данные, полученные в результате генетического отслеживания и scRNA-seq, Лу и ее группа создали "молекулярные мосты" с помощью полимеразной цепной реакции для амплификации молекул, содержащих оба штрих-кода. Затем они сопоставили выход линии одиночных клеток с экспрессией генов в библиотеке кДНК, чтобы создать базу данных молекулярных мостов.
Далее исследователи использовали эту базу данных для количественной оценки выхода линий ГСК у разных мышей, измеряя уровни транскрипции генов, связанных с производством клеток крови. Они выявили около 40 генов, ассоциированных с производством клеток крови, причем некоторые из них имеют отношение к заболеваниям, которые влияют на производство иммунных клеток. Было обнаружено, что некоторые гены связаны с производством лимфоидных клеток, а другие - с балансом различных иммунных клеток.
Чтобы глубже изучить ассоциации между активностью генов и количеством и разнообразием производимых иммунных клеток, Лу проанализировала гены по всему спектру продукции линий. Вместо того чтобы просто классифицировать их как низкие или высокие, она провела более комплексный анализ, чтобы выявить гены, которые могут иметь особое значение. "Полученные результаты говорят нам о том, что существует некий механизм или количественные закономерности ассоциирования, которые мы еще не осознали в полной мере, а именно то, как гены количественно контролируют поведение клеток", - отметила Лу.
Исследователи обнаружили, что гены коррелируют с количеством и типом клеток крови по четырем моделям ассоциации: постоянной, унимодальной, дискретной и мультимодальной. Они выявили несколько генов с постоянной ассоциацией, когда экспрессия гена всегда связана с производством лимфоцитов. В случае дискретно ассоциированных генов производство лимфоцитов находилось в определенном диапазоне уровней. Чаще всего гены попадали в категорию унимодальных или мультимодальных. В унимодальных ассоциациях выход клеток зависит от состояния экспрессии гена и напоминает переключатель "включено/выключено". Однако в мультимодальных ассоциациях активность генов происходит на нескольких уровнях или порогах для нескольких различных количеств клеточной продукции.
"В этом исследовании используется умная технология, которая включает в себя сложные молекулярно-биологические и вычислительные подходы. Это совершенно новый подход к тому, как мы отслеживаем и оцениваем стволовые клетки крови и их продукцию", - заметил Дэвид Кент, биолог стволовых клеток из Университета Йорка, который не принимал участия в исследовании. "Этот метод закладывает основу для ответов на новые вопросы, поэтому я рассматриваю его как важный инструмент развития".
Благодаря этой работе Лу надеется выйти на новый уровень прецизионной медицины. "Понимая разницу между отдельными клетками, мы сможем заставить все клетки делать то, что нам нужно. Это действительно позволит использовать естественные различия между отдельными клетками для управления клеточными популяциями", - считает она.
