В китайской мифологии хитрая лиса с девятью хвостами символизирует мир и процветание.
Сяо Ванг, химик-биолог из Массачусетского технологического института, черпала в этой многохвостой лисе свое научное вдохновение. Ванг и ее коллеги заинтересовались синтезом различных видов РНК, которая обычно имеет линейную форму с одним хвостом полиА, важным для производства белка. Этот хвост является лимитирующим этапом для деградации мРНК. "Мы задались вопросом: почему бы нам не сделать несколько хвостов?", - рассказывает Ванг. "Ведь если мы потеряем один, то у нас будет несколько других".
К мРНК было привлечено большое внимание после появления вакцин с модифицированной РНК во время пандемии COVID-19. Однако модифицированная РНК нестабильна и превращается в белок неэффективно, что делает необходимым введение высоких доз, которые могут быть токсичными для пациента при терапевтическом использовании. Чтобы решить эти проблемы, Ванг и ее группа разработали мРНК с несколькими полиА-хвостами вместо одного. Недавно в журнале Nature Biotechnology ученые сообщили, что такая разветвленная мРНК живет значительно дольше и эффективнее транслируется, открывая путь к созданию следующего поколения мРНК-вакцин и терапий.
Ванг и ее сотрудники сначала стабилизировали хвост полиА, добавив некоторые модификации, чтобы защитить его от разгрызания нуклеазами. Чтобы добавить несколько полиА-хвостов к основе мРНК и создать разветвленную структуру, ученые использовали "химию защелкивания" - набор реакций, используемых для соединения двух молекулярных единиц. Дополнительные модификации помогли предотвратить прилипание хвостов друг к другу.
Ванг и ее коллеги обнаружили, что три полиА-хвоста являются оптимальным вариантом. Присоединение слишком большого количества хвостов чрезвычайно затрудняло очистку разветвленной мРНК с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии. "Вы можете себе представить, что если мы с определенным успехом лигируем один из хвостов полиА, то с увеличением этого показателя выход снижается в геометрической прогрессии", - говорит она.
Затем ученые прикрепили к мРНК флуоресцентный репортер и экспрессировали ее в культивируемых клетках, чтобы измерить, как долго разветвленная мРНК будет находиться внутри клетки и будут ли рибосомы ее транслировать. Определив количество транскриптов мРНК, тех, что находятся внутри клетки, и тех, что связаны с рибосомами, они обнаружили, что эффективность трансляции разветвленной мРНК была примерно в 1,5 раза выше, чем у линейной мРНК.
Эти результаты были воспроизведены в мышиной модели, где ученые вводили разветвленную мРНК (или линейную мРНК), содержащую флуоресцентный репортер, в глаза мышей. Они обнаружили, что разветвленная мРНК генерировала флуоресцентный сигнал, в три-пять раз превышающий контрольный примерно через два дня после инъекции, и этот сильный сигнал сохранялся в течение долгого времени, указывая на то, что разветвленная мРНК не подвергалась деградации и не переводилась в белок.
Чтобы продемонстрировать пригодность разветвленной мРНК в терапевтическом смысле, Ванг и ее группа решили использовать разветвленную мРНК для улучшения системы редактирования CRISPR-Cas9. "В условиях редактирования генома белок становится более ограничивающим фактором, поэтому использование дополнительных полиА хвостов для производства большего количества белка Cas9 будет полезным", - утверждает Ванг. Когда исследователи проверили это на мышиной модели, они обнаружили, что разветвленная мРНК привела к четырехкратному увеличению экспрессии белка Cas9 по сравнению с линейным контролем и значительно более низкому уровню целевого белка.
По словам Аллана Якобсона, биолога из Медицинской школы Массачусетского университета, не участвовавшего в исследовании, эти результаты интересны. "Это полезно, потому что если вы делаете прививку, вы можете сделать ее в меньшем объеме", - сказал он. "И если есть опасения по поводу побочных эффектов, вы уменьшаете их". Ему интересно посмотреть, как ученые будут решать проблему массового производства в будущем, учитывая, что создание разветвленной мРНК требует длительного процесса очистки.
Тем временем Ванг и ее коллеги расширяют границы модификации мРНК в надежде, что однажды это поможет создать лучшие вакцины или терапию. "Нам интересно найти различные структуры и модификации, которые могут быть восприняты клеткой", - рассказала она. "Интересно посмотреть, как трансляционный механизм реагирует на мРНК, которые он никогда раньше не видел".
