За последнее десятилетие омика произвела революцию в диагностической микробиологии: геномные исследования нашли применение в диагностике и эпидемиологии, а протеомные - в масс-спектрометрии (MALDI-TOF) для идентификации бактерий и грибов.
Развитие диагностических приложений третьего "омического" метода, метаболомики, отстает от двух других. Однако последние исследования показывают, что метаболомика также может играть важную диагностическую роль.
Когда живые организмы метаболизируют органические соединения, образуются сотни и тысячи химически сложных продуктов/побочных продуктов, называемых "летучими органическими соединениями" (ЛОС). ЛОС имеют высокое давление пара при комнатной температуре и могут быть обнаружены как "запахи"или "ароматы", которые впоследствии могут быть использованы для целей идентификации при применении достаточно чувствительного метода анализа. С помощью метаболомных методов ЛОС могут быть обнаружены в самых разных типах образцов, включая изоляты патогенов, выдыхаемый воздух, мокроту, фекалии, слюну, мазки из носоглотки и горла и вагинальные выделения.
Метаболомный анализ основывается на датчиках для обнаружения ЛОС и процессоре для их идентификации. После идентификации проводится анализ данных для поиска уникальных паттернов ЛОС, связанных с определенными состояниями заболевания или идентификацией микроорганизма. Целью анализа данных является обнаружение специфических ЛОС или биомаркеров, которые ассоциируются с определенными состояниями заболевания или патогенами. В отсутствие специфических биомаркеров образцы ЛОС из клинических образцов или изолятов сравниваются с библиотеками данных, состоящими из известных образцов ЛОС, обнаруженных при определенных состояниях заболевания или клинических изолятах. Этот принцип аналогичен тому, который используется для идентификации бактерий и грибов с помощью MALDI-TOF MS.
Хотя термин "метаболомика" может быть новым для многих диагностических микробиологов, использование запахов для выявления инфекционных заболеваний или идентификации микроорганизмов так же старо, как медицина и диагностическая микробиология. Человеческий нос естественным образом функционирует как "сенсор", обонятельные нервы - как "процессор", а мозг осуществляет распознавание образов как "идентификатор" конкретных инфекционных заболеваний или организмов. С древности гниение и абсцессы ассоциировались с неприятным запахом, который, как теперь известно, вызывается специфическими пахучими метаболитами, такими как кадаверин и путресцин. Мало кто из студентов-медиков забудет зловонный запах изо рта своего первого пациента с анаэробным абсцессом легкого.
Преодолев первоначальное чувство тошноты при встрече с "особым запахом" лаборатории клинической микробиологии, студенты медицинских лабораторий вскоре учатся распознавать запахи частых ее посетителей: виноградный запах Pseudomonas aeruginosa, карамельно-сладкий запах Streptococcus anginosus, землистый запах Nocardia и Mycobacterium и сладкий запах Candida. Лица, обрабатывающие образцы от пациентов с инфекциями Clostridioides difficile, могут заметить запах "конюшни", и анализ ЛОС предполагает, что высокий уровень метаболита 4-метилфенола может способствовать этому довольно неприятному запаху. Положительный "тест на запах" является одним из 4 критериев Амселя для диагностики бактериального вагиноза. Тест на запах является положительным, если присутствует "рыбный" запах из-за выделения аминов при добавлении 10% KOH на предметное стекло вагинальных выделений пациентки.
Животные, такие как собаки и крысы, имеют гораздо более чувствительную обонятельную систему, чем люди. Собак используют для слежения за людьми и обнаружения наркотиков, взрывчатых веществ и оружия. В недавнем исследовании собаки использовались даже для обнаружения C. difficile в больничной среде и продемонстрировали чувствительность обнаружения 92%. Собаки также использовались для обнаружения бактериурии в образцах мочи с чувствительностью скрининга, близкой к 100%, и специфичностью от 90 до 95%. Использование собак для выявления бактериурии может оказаться непрактичным, но использование их в качестве комфортных животных, которые также способны выявлять C. difficile в больничных условиях, является интересной идеей. (Об использовании собак для выявления лиц, которые могут быть положительны на SARS-CoV-2 можно прочитать здесь).
Африканские гигантские крысы были обучены обнаруживать Mycobacterium tuberculosis в мокроте, взятой у людей с подозрением на туберкулез. В крупном исследовании, в котором образцы были получены от более чем 10 000 человек, а частота позитивности мазков составляла 13%, крысы выявили 95% положительных образцов. Кроме того, крысы обнаружили M. tuberculosis еще у 1 335 пациентов, у которых при первичном обследовании мазок был отрицательным. Когда мазки от этих 1335 пациентов были повторно исследованы микроскопически, 620 из них оказались положительными. Скрининг с использованием крыс повысил выявляемость на 44%, а общая специфичность составила 90%. Было бы интересно сравнить скрининг с помощью крыс с более чувствительным методом ПЦР для выявления M. tuberculosis. Поскольку крысы более экономически эффективны и не требуют сложной инфраструктуры тестирования или оборудования, эта диагностическая альтернатива особенно привлекательна для стран с низким уровнем жизни.
Ниже описаны несколько исследований, которые отражают перспективы и проблемы использования метаболомики в качестве диагностического инструмента. Во всех четырех исследованиях использовалась комбинация газовой (ГХ) или жидкостной хроматографии (ЖХ)-масс-спектрометрии (МС). Эти типы приборов занимают большую площадь и требуют операторов с продвинутыми техническими навыками. Кроме того, проблемы сбора, транспортировки и качества образцов ограничивают их использование только в исследовательских целях.
Метаболомика для диагностики Pseudomonas aeruginosa
Первое исследование, представляющее интерес, является непосредственным доказательством концепции. В этом исследовании 2-аминоацетофенон использовался в качестве биомаркера для обнаружения Pseudomonas aeruginosa в выдыхаемом воздухе пациентов с муковисцидозом (МВ). Используя метод ЖХ-МС, ученые обнаружили, что 15/16 больных МВ с P. aeruginosa были положительны на 2-аминоацетофенон, в то время как только 5/17 здоровых контрольных лиц и 4/13 больных МВ с отрицательной P. aeruginosa были положительны. Более того, концентрация 2-аминоацетофенона в выдыхаемом воздухе была значительно выше у лиц с P. aeruginosa, что указывает на возможность использования количественных уровней 2-аминоацетофенона для дифференциации образцов, положительных на P. aeruginosa, от отрицательных. К сожалению, количественное определение аналитов значительно усложняет такие анализы, а затраты и преимущества являются важными соображениями при внедрении любого анализа.
Последующие исследования показали, что употребление кукурузных чипсов приводит к высокому уровню 2-аминоацетофенона в выдыхаемом воздухе вскоре после употребления, который исчезает через 2 часа. Это неудивительно, поскольку некоторые люди описывают запах P. aeruginosa как запах кукурузных чипсов. Убедиться, что пациенты не ели и не пили в течение 2 часов, предшествующих тестированию, стало стандартной практикой при проведении дыхательного теста. Но поскольку P. aeruginosa и так достаточно легко выделяется и идентифицируется из дыхательных путей, использование метаболомики для обнаружения P. aeruginosa не получило дальнейшего развития для диагностического применения.
Метаболомика для диагностики инвазивного легочного аспергиллеза
Инвазивный легочный аспергиллез (ИЛА) представляет собой особенно сложную диагностическую проблему. Поскольку Aspergillus spp. повсеместно распространены в окружающей среде, верхние дыхательные пути могут быть колонизированы и давать ложноположительные результаты при культивировании. Что еще более важно, могут возникать ложноотрицательные результаты культивирования мокроты и бронхо-альвеолярного лаважа, поскольку организм склонен инвазировать эндотелиальные клетки. Оптимальный диагностический подход требует инвазивного исследования легочной ткани, либо гистологического, либо культурального. Но к сожалению, пациенты, у которых наиболее вероятно развитие ИЛА, - это пациенты со злокачественными опухолями или трансплантацией костного мозга: две группы пациентов, которые чаще всего страдают тромбоцитопенией, что не позволяет им проводить биопсию легочной ткани.
В недавнем исследовании у пациентов с ИЛА (n=34) и соответствующей отрицательной контрольной группы (n=30) использовался анализ дыхания с помощью ГХ-МС, который показал, что присутствие любого метаболита из 4-х метаболитов, состоящих из α- или β-транс-бергамотена, транс-геранилацетона или β-ватиренена, имеет 94% чувствительность и 93% специфичность для выявления ИЛА. Преимуществом данного метода является простота получения образца. Однако стандартизация сбора образцов и воспроизводимость анализа - это лишь некоторые из вопросов, на которые пока нет ответов.
Метаболомика для диагностики бактериального вагиноза
Здоровый микробиом с преобладанием лактобацилл давно ассоциируется со здоровьем влагалища. Бактериальный вагиноз (БВ) является важным клиническим примером дисбиоза. Дисбиоз при БВ возникает, когда преобладание лактобацилл нарушается и заменяется различными анаэробными бактериями. БВ ассоциируется с повышенной вероятностью передачи и заражения ВИЧ и другими инфекциями, передающимися половым путем, а также с повышенным риском преждевременных родов. Диагностические инструменты для диагностики БВ в настоящее время включают либо систему оценки окраски по Граму (Nugent score), которая зависит от работы врача-лаборанта и связана со значительной погрешностью, либо тест "на запах" (критерии Амселя, как описано выше).
Метаболомный анализ с помощью ГХ-МС вагинальных мазков показал, что образцы с высоким соотношением 2-гидроксиизовалерата: тирозина и γ-гидроксибутирата: тирозина способны предсказать БВ с 91% точностью, что позволяет предположить, что эти два метаболита могут быть использованы в качестве биомаркеров БВ. Однако, поскольку в качестве референсного метода в исследовании использовалась система оценки Nugent, которая сильно зависит от работы лаборанта, эти данные следует рассматривать с осторожностью, и необходима дальнейшая валидация.
Метаболомика для диагностики гриппа
Возможно, одной из самых интересных областей применения метаболомики является диагностика гриппа по мазкам из носоглотки. Снижение уровня биомаркера пироглутамата в носоглоточных образцах пациентов, инфицированных вирусом гриппа, было надежно обнаружено с помощью ЖХ-МС и машинного обучения. Авторы исследования предполагают, что изменения в метаболизме глутатиона в клетках, инфицированных вирусом гриппа, были ответственны за снижение уровня пироглутамата, который является побочным продуктом деградации глутатиона. Важно признать, что в отношении этого метода остается много вопросов без ответов, и все еще требуются тщательные клинические испытания, однако потенциал этого метода представляется многообещающим.
Метаболомные исследования с использованием "электронного носа"
Электронный нос (E-nose) - это портативное устройство, использующее специальные биосенсорные матрицы, которые реагируют с ЛОС, присутствующими в запахах, создавая различные электронные сигналы. Эти сигналы сравниваются с уже существующими библиотеками сигналов для идентификации конкретных веществ. Модели варьируют от простых до очень сложных. Этот метод, впервые примененный в 1982 году, имеет широкий спектр применения в пищевой промышленности, а также для обнаружения различных химических воздействий и экологических опасностей, однако применение в диагностической микробиологии было более ограниченным. Исследования по выявлению инфекционных заболеваний с помощью E-nose, как правило, имеют небольшое количество испытуемых и не предназначены для обнаружения конкретных организмов. Кроме того, хотя во всех исследованиях в качестве типа образца использовалось выдыхаемое дыхание, между исследованиями с использованием электронного носа существуют значительные различия в сборе образцов и контингентах пациентов, что делает сравнение между исследованиями затруднительным или невозможным.
Cyranose 320 с текстовой маркировкой всех функциональных элементов электронного носа.
Исследования электрических носов проводились почти 40 лет и не дали практически никаких данных, имеющих отношение к диагностической микробиологии, так почему же возник интерес к этому устройству? Это связано с растущим желанием проводить анализы "рядом с пациентом", поэтому большой интерес представляют портативные устройства, способные определять биомаркеры различных инфекционных агентов, с которыми пациенты поступают в отделения неотложной и экстренной помощи. Преимуществом портативного устройства является портативность, позволяющая использовать его у постели больного. Возможность тестирования легко собираемых образцов, таких как выдыхаемый воздух, мазки из носоглотки или горла или моча, снижает инвазивность и риск для пациента. Наконец, быстрое время выполнения теста сокращает время между поступлением пациента и назначением целенаправленного и эффективного лечения.
В области метаболомики остается много проблем и вопросов. Можно ли разработать устройства с биосенсорными матрицами для обнаружения конкретных инфекционных заболеваний и/или патогенов? Если да, то когда будут определены и доступны библиотеки паттернов и/или биомаркеров для конкретных патогенов? Может быть, метаболомика просто слишком отстает от геномики и протеомики в диагностике инфекционных заболеваний, чтобы быть в значительной степени применимой для диагностики инфекционных заболеваний?
Время покажет, но пока любопытные ученые готовы рискнуть и поискать ответы.
