Методы секвенирования следующего поколения (NGS) начали упоминаться в литературе в середине 2000-х годов и оказали трансформирующее влияние на наше понимание микробной геномики и инфекционных заболеваний. Тем не менее, существуют многочисленные споры о том, как, когда и где секвенирование следующего поколения будет играть роль в клинической микробиологической лаборатории.
Что такое метагеномное секвенирование следующего поколения?
Секвенирование следующего поколения - это любой из нескольких высокопроизводительных методов секвенирования, с помощью которых можно одновременно и независимо секвенировать миллиарды фрагментов нуклеиновых кислот. Этот метод отличается от классических методов, таких как секвенирование по Сэнгеру (также известное как секвенирование с дидезоксинуклеотидной терминацией цепи), которое обрабатывает одну нуклеотидную последовательность за реакцию.
Например, чтобы охарактеризовать бактериальный геном с помощью NGS, геном разделяется на множество фрагментов, которые дают последовательности или чтения длиной от сотен до десятков тысяч оснований. Эти последовательности собираются в единый геном с помощью вычислительных методов. Несколько перекрывающихся чтений последовательности собираются вместе, чтобы получить одну более длинную последовательность, называемую контигом. Между контигами часто остаются пробелы, и хотя идеальным методом секвенирования были бы высокоточные длинные чтения последовательностей, платформы, производящие более короткие чтения, обычно менее дорогостоящие, а перекрытие последовательностей делает их более точными. Сконструированный геном (вероятно, содержащий пробелы) выравнивается по эталонной базе данных для идентификации организма. Эта технология представляет собой значительный прогресс по сравнению с первыми разработками секвенирования, когда реализация проекта по созданию генома одной бактерии могла занять несколько лет.
Метагеномное NGS (mNGS) - это секвенирование всех нуклеиновых кислот в образце, который может содержать смешанные популяции микроорганизмов, и приведение их в соответствие с эталонными геномами, чтобы понять, какие микроорганизмы присутствуют и в каких пропорциях. Возможность последовательности и идентификации нуклеиновых кислот из множества различных таксонов для метагеномного анализа делает его новой мощной платформой, которая может одновременно идентифицировать генетический материал из совершенно разных царств организмов.
Возможные клинические применения огромны, включая диагностику инфекционных заболеваний, отслеживание вспышек, инфекционный контроль, обнаружение мутаций и патогенов, и многие другие. mNGS, иногда называемый дробовым (shotgun) секвенированием, применялся для клинических образцов различных типов, включая спинномозговую жидкость, кровь, образцы дыхательных путей, желудочно-кишечную жидкость и глазное отделяемое.
Каковы преимущества метагеномного секвенирования следующего поколения?
Самая большая ценность mNGS заключается в том, что это беспристрастный метод диагностики без гипотез, в отличие от разновидностей ПЦР, которые полагаются на праймеры для идентификации конкретных мишеней, подлежащих амплификации и обнаружению. Даже универсальные или широкодиапазонные методы ПЦР не являются достаточно широкими, чтобы считаться метагеномными, поскольку они используют специфические праймеры консервативных последовательностей гена 16S рибосомальной РНК (рРНК) и внутреннего транскрибируемого спейсера (ITS) для амплификации характерных последовательностей нуклеиновых кислот, которые могут быть биоинформационно классифицированы как бактерии/археи или грибы соответственно.
Универсальные праймеры также представляют собой проблему при диагностике полимикробных инфекций с помощью молекулярных тестов. При наличии полимикробных популяций при использовании 16S секвенирования на каждый нуклеотид будет приходиться несколько base-calls, что приводит к получению смешанной нуклеотидной хроматограммы, которую невозможно интерпретировать. Хотя существуют деконволюционные вычислительные методы для предсказания идентифицированных организмов, они не являются стандартными для многих лабораторий, которые часто переходят к секвенированию гена 16S следующего поколения для полимикробных образцов.
Каковы проблемы метагеномного секвенирования следующего поколения?
Несмотря на потенциал mNGS, существует множество препятствий, которые необходимо преодолеть, прежде чем эта технология станет частью обычной лаборатории, а также пробелы в нашем понимании ее диагностической пользы. К основным препятствиям относятся интерпретация результатов (различение контаминации и колонизации от истинных патогенов), выбор и валидация баз данных, используемых для анализа, и прогнозирование (или отсутствие такового) чувствительности к противомикробным препаратам.
Распространено мнение, что mNGS настолько невероятно чувствительно, что оно выявляет диагноз, когда все другие тесты отрицательны. Хотя в некоторых случаях mNGS может быть аналитически более чувствительно, чем стандартные методы культивирования, необходимое удаление огромного количества нуклеиновой кислоты человека во время подготовки секвенирования и (с помощью вычислительных методов) во время постаналитического процесса, что может снизить чувствительность по сравнению с целевыми методами ПЦР для многих организмов.
Специфичность mNGS также является проблемой. Контаминация образцов во время сбора образцов вызывает большую озабоченность, учитывая повышенную аналитическую чувствительность mNGS по сравнению со стандартными культуральными методами, и необходим валидированный процесс контроля качества на всех этапах - от оценки чистоты реагентов до измерения адекватного контроля покрытия генома.
Кроме того, на некоторых платформах Illumina могут быть указаны неправильные индексы штрих-кодов, что приводит к ложноположительным результатам данных секвенирования. Биоинформационный контроль качества необходим для обеспечения высокого качества и валидированных геномов с минимальными ошибками в базе данных, и в идеале должен присутствовать персонал с опытом биоинформатики для интерпретации результатов секвенирования для каждого теста, чего нет в большинстве клинических микробиологических лабораторий.
Более важным остается вопрос о клинической специфичности mNGS: являются ли обнаруженные последовательности патогенами, вызывающими текущее заболевание пациента? Аналитическая специфичность тестирования mNGS может быть решена с помощью строгого контроля на всех этапах сбора образцов, подготовки библиотеки секвенирования, проведения анализа и биоинформационной классификации, но клиническая специфичность не решается напрямую с помощью этих подходов.
Вопросы, которые могут помочь определить клиническую целесообразность и применимость, включают:
- Как отличить организмы, связанные с транзиторной бактериемией, от флоры полости рта/желудочно-кишечного тракта или колонизаторов кожи при тестировании mNGS крови/плазмы?
- Как следует указывать глубину секвенирования и насколько достоверна связь глубины секвенирования с истинной инфекцией?
- Различается ли эта связь в зависимости от патогена/хозяина?
- Какова ожидаемая продолжительность периода полураспада патогена, выявляемого с помощью mNGS, после того как пациент получает соответствующую терапию?
Несмотря на неоспоримые возможности этой технологии с точки зрения исследований и открытий, крайне необходимы исследования клинической целесообразности и экономической эффективности.
Стоит также отметить, что в настоящее время не существует сертифицированных тестов mNGS, которые можно было бы использовать для исследования микроорганизмов. На сегодняшний день лишь несколько диагностических NGS-систем получили разрешение FDA, например, для проведения онкологических исследований или выявления муковисцидоза.
В целом, несмотря на то, что тестирование mNGS может сыграть важную роль в микробиологической диагностике в будущем, особенно по мере развития возможностей секвенирования и биоинформационных технологий, этот метод остается технологией высокой сложности, клиническое применение которой в современной медицинской практике остается неопределенным. Хотя в ближайшем будущем тестирование с помощью mNGS может предложить новые и захватывающие клинические диагностические возможности ничто из этого не заменит в ближайшее время проницательного бактериолога.
