Известно, что взаимодействие хозяина и патогена характеризуется множественными фенотипами, зависящими от переменной активации механизмов вирулентности бактерий, а также гетерогенными защитными реакциями хозяина, что требует применения подхода, основанного на изучении отдельных клеток.
Взаимодействие между патогенными внутриклеточными бактериями и их хозяевами включает в себя как активацию скоординированного защитного ответа макрофагов хозяина, так и сложную программу вирулентности, выполняемую бактериями. Для вторжения и выживания во враждебной клеточной среде хозяина внутриклеточные патогены используют системы секреции, которые доставляют эффекторные белки через фосфолипидные мембраны из бактерии в цитоплазму хозяина. Широкий спектр систем секреции позволяет различным патогенам выживать в клетках хозяина. Один из наиболее изученных внутриклеточных патогенов, Salmonella Typhimurium, использует систему секреции III типа (T3SS), расположенную на острове патогенности Salmonella (SPI)-2, чтобы перестроить фагосомы хозяина в гостеприимную вакуоль и создать защитную нишу внутри макрофагов.
SPI-2 опосредует секрецию 28 эффекторов из фагосомы макрофага для манипулирования процессами в клетках хозяина и обеспечения репликации бактерий внутри вакуоли, содержащей сальмонеллы. В последние годы становится все более очевидным, что секреция эффекторов гетерогенна у отдельных внутриклеточных бактерий, что приводит к различным сложным фенотипам. Было показано, что в пределах одной популяции, как in vitro, так и in vivo, Salmonella Typhimurium демонстрирует гетерогенную экспрессию T3SS, которая ассоциируется с различной скоростью роста, чувствительностью к антибиотикам, реакцией хозяина и локализацией бактериальных клеток в местах инфицирования.
В дополнение к этой сложности наблюдается избыточность деятельности эффекторов, поскольку отдельные эффекторы T3SS сходятся к единому пути развития инфекции хозяина. Недавние исследования также показали, что один эффектор Salmonella Typhimurium может связывать множество белков хозяина, которые ассоциированы с несколькими клеточными процессами. Избыточность и гетерогенность отдельных эффекторов считаются полезными для патогена с точки зрения успешного развития инфекции, но затрудняют определение функций отдельных эффекторов, поэтому систематическое понимание активности эффекторов системы секреции до сих пор отсутствует.
Со стороны хозяина макрофаги, инфицированные Salmonella Typhimurium, демонстрируют гетерогенные фенотипы во время внутриклеточной инфекции. Секвенирование РНК в отдельных клетках (scRNA-seq) все чаще используется для изучения факторов хозяина, лежащих в основе различных клеточных фенотипов, но имеет ограниченные возможности для анализа роли бактериальных факторов. Исследования с использованием scRNA-seq выявили признаки субпопуляций макрофагов, которые демонстрируют различные результаты: некоторые из них благоприятствуют внутриклеточному росту бактерий; другие лизируют поглощенные бактерии; третьи позволяют бактериям сохраняться внутриклеточно.
Однако методы scRNA-seq ограничены профилированием только транскриптов хозяина, поскольку они полагаются на полиА-прайминг мРНК, в то время как бактериальные мРНК не содержат полиА. Гетерогенная и динамичная природа бактериальных патогенов предполагает, что описание, ограниченное только иммунными признаками, может не дать точной характеристики всего спектра взаимодействий с различными сложными фенотипами. Усилия по проведению профилирования бактерий на одноклеточном уровне имеют ограниченную чувствительность для обнаружения бактериальных генов, что затрудняет биологическую интерпретацию в контексте инфекции.
В качестве альтернативы систематический анализ функции бактериальных генов можно проводить серийно либо в виде массивов или объединенных генетических экранов, но он в основном ограничивается автономными фенотипами, а не взаимодействием с хозяином, и нечувствителен к бактериальной гетерогенности. Таким образом, в нашей способности изучать факторы макрофагов и бактерий, которые регулируют стратегии выживания при индивидуальных встречах, остается значительный пробел. Знание этих факторов имеет фундаментальное значение для нашего понимания биологии инфекции.
Для решения этой проблемы мы представляем scPAIR-seq - вычислительную и экспериментальную систему анализа мутант-специфических иммунных реакций патогенов в отдельных клетках. В нашем подходе используются бактериальные мутанты, помеченные уникальным полиаденилированным штрих-кодом (Molecular Identifier of Bacterial mutant; MIB), который может быть обнаружен с помощью любого протокола RNA-seq для отдельных клеток. Мультиплексирование нескольких мутантов, каждый из которых имеет уникальный штрих-код, позволяет объединять библиотеки бактериальных мутантов, сохраняющих свою идентичность на основе последовательности MIB.
Объединенные библиотеки мутантов могут быть использованы в интересующей нас модели инфекции. Мы оптимизировали протоколы scRNA-seq для обнаружения в одной инфицированной клетке-хозяине как идентичности бактериального мутанта, так и транскрипционного профиля соответствующего хозяина. Мы разработали вычислительный конвейер для анализа мутант-зависимых изменений в программах активации хозяина, чтобы обеспечить функциональную перспективу каждого бактериального мутанта во время взаимодействия хозяина и патогена.
В качестве эксперимента мы создали объединенную библиотеку эффекторных мутантов Salmonella Typhimurium SPI-2 с MIB-метками (всего 25 штаммов) и проследили их воздействие на хозяина с помощью анализа транскриптома единичных инфицированных макрофагов. Мы определили конкретные мишени хозяина, генные сигнатуры и состояния клеток, на которые влияют отдельные мутанты SPI-2. Используя этот подход, мы проанализировали иммунный ответ макрофагов, инфицированных объединенной библиотекой мутантов системы секреции SPI-2 Salmonella. Мы обнаружили эффекторы SPI-2, которые сходятся в иммунных сетях хозяина, а также изменения экспрессии генов хозяина, зависящие от мутанта. scPAIR-seq можно применять для изучения взаимодействия между хозяином и патогеном в любом штамме бактерий и модели инфекции.
ScPAIR-seq - мощный инструмент для распутывания стратегий вирулентности бактерий и их сложного взаимодействия со стратегиями защиты хозяина, которые определяют исход инфекции.
