Бактерии используют различные механизмы для общения друг с другом.
Одним из известных механизмов межклеточной коммуникации является кворум-сенсинг (QS), при котором бактерии выделяют, распознают и отвечают на химические мессенджеры в зависимости от плотности их популяции. Однако механизм QS у микобактерий до сих пор плохо изучен.
В отличие от грамположительных и грамотрицательных бактерий, клеточная стенка микобактерий богата липидами, что привело к давнему убеждению, что этот жесткий липидный слой не позволяет внеклеточным лигандам/сигналам достигать рецепторных белков, и поэтому микобактерии считаются некоммуникабельными бактериями. Однако ряд экспериментальных данных свидетельствует о том, что микобактерии демонстрируют поведение, связанное с QS, такое как биопленка, образование мембранных везикул и горизонтальный перенос генов.
Взаимодействие между клетками является необходимым условием для производства компонентов, связанных с QS. Бактериальное взаимодействие может оказать значительное влияние на эволюционную динамику, если взаимодействующие бактерии присутствуют при высокой плотности клеток, чтобы они могли воспринимать друг друга через прямой межклеточный контакт или сигнальные молекулы QS.
У мышей, инфицированных активным штаммом Mycobacterium tuberculosis (Mtb), через 10 дней на одно легкое приходилось около 10 000 бацилл, тогда как через 20 дней наблюдалось 10 миллионов бацилл на легкое, что говорит о том, что микобактерии существуют с высокой плотностью во время активного туберкулеза. Такие высокоплотные микобактериальные клетки существуют в виде нитевидных или агрегированных форм и устанавливают межклеточную коммуникацию через контактно-зависимый или независимый механизм для преодоления стрессовых условий, вызванных хозяином, посредством обмена молекулами.
Дыхательные пути пациентов с муковисцидозом инфицированы множеством патогенов, включая различные генотипы Mycobacterium abscessus, Pseudomonas aeruginosa и Staphylococcus aureus, что предполагает, что микобактерии могут взаимодействовать с различными видами бактерий в нише. Хотя микобактерии в основном инфицируют легкие, многие генотипы распространяются во внелегочные органы, такие как печень и селезенка. При инфицировании других частей тела, таких как кожа и мягкие ткани, микобактерии могут взаимодействовать с местной микробиотой, конкурируя за пространственное расслоение и питательные вещества. Однако до сих пор не было исследований, подтверждающих связь взаимодействия микобактерий с другими видами бактерий. Сосуществование различных видов микобактерий вместе с несколькими патогенами в легких пациентов, вероятно, функционирует как полимикробное патогенное сообщество, которое может быть причиной повторяющихся неудач в лечении, поскольку каждый вид и генотип имеет различный диапазон чувствительности к антибиотикам.
Таким образом, цель данного обзора - обсудить последние данные о коммуникации микобактерий и о том, как они используют социальное поведение для обеспечения своей персистенции в организме хозяина.
Персистенция микобактерий увеличивается с ростом гетерогенности
Из-за недостаточного развития молекулярных методов в последние несколько десятилетий считалось, что микобактерии, опосредованные легочной инфекцией, вызываются одним типом генетически консервативного штамма. Однако с помощью последних достижений в области молекулярных методов было доказано, что многочисленные штаммы микобактерий попадают в легкие путем множественной независимой передачи, пространственно распределенной по различным участкам легких. Интересно, что, согласно немногочисленным сообщениям, пациенты, инфицированные Mtb, также необычно коинфицированы нетуберкулезными микобактериями (НТМ). НТМ вызывают широкий спектр заболеваний в различных органах организма пациентов с ослабленным иммунитетом.
Возникновение гетерогенных клональных популяций среди микобактерий является неизбежной стратегией выживания, которая обеспечивает приспособленность микобактерий к противостоянию враждебной среде хозяина. Поскольку такие факторы, как удлинение клетки, репликация ДНК, сегрегация хромосом и деление клетки, являются несинхронизированными событиями в микобактериях, часто наблюдается вариабельность их роста. В результате асимметричного деления клеток компоненты клеточной стенки микобактерий неравномерно распределяются в делящихся дочерних клетках, что приводит к изменчивому ответу на антибиотики и иммунитет хозяина. Эмпирические данные показали, что у микобактерий, дефектных по продуцированию LamA, снижен асимметричный рост и не удается создать гетерогенные клональные популяции. Также было замечено, что из-за отсутствия гетерогенности антибиотики, нацеленные на клеточную стенку, эффективно убивают клетки микобактерий с дефектом LamA, что подразумевает, что гетерогенность клеточной стенки играет важную роль в жизнеспособности. Неудивительно, что неправильная транслокация белка также способствует возникновению резистентности микобактерий к рифампицину в условиях in vitro.
Существует адекватное представление о том, что гетерогенность микобактерий также регулируется иммунным статусом хозяина. Почувствовав бактериальные компоненты, иммунные клетки собираются в месте инфекции, что приводит к образованию поражений. Вскрытие очагов поражения у больных туберкулезом показало, что очаги поражения неоднородны по клеточному составу и структурной организации. В результате антибиотики легко проникают в определенные очаги поражения, в то время как некоторые очаги получают наименьшую концентрацию антибиотиков, что приводит к появлению резистентных к антибиотикам подмножеств бактерий. У мышей с дефицитом выработки интерферона γ популяции микобактерий менее гетерогенны, чем у мышей дикого типа, что подтверждает, что иммунные клетки хозяина также влияют на физиологию микобактерий. Можно предположить, что гетерогенность клональных популяций позволяет им проявлять различные индивидуальные способности переносить разнообразные стрессовые факторы, что может привести к сохранению значительного количества клеток даже в присутствии многочисленных атак. Однако для успешной колонизации и выживания необходима кооперация между гетерогенными микобактериями.
Кооперация среди гетерогенных микобактерий
У микобактерий обмен генетическим материалом происходит между клетками-донорами и клетками-реципиентами системным образом, в котором секреторная система VII типа играет жизненно важную роль на протяжении всего процесса. В результате переноса хромосомной ДНК между микобактериями образуются трансконъюганты с мозаичными геномами родительских штаммов. В процессе DCT (distributive conjugal transfer - дистрибутивная конъюгационная передача) в геномы трансконъюгантов могут быть вставлены новые гены или опероны бактерий-доноров, или их основные гены могут быть заменены на сегмент бактерий-доноров, что приводит к изменению биохимических путей в трансконъюгантах, что может повлиять на приспособленность трансконъюгантов.
Из-за беспорядочной репликации ДНК дочерние клетки могут потерять важные гены, кодирующие метаболиты/белки, что заставляет их зависеть от соседних клеток в отношении питательных веществ. Хотя о взаимном обмене необходимыми питательными веществами сообщалось у различных бактериальных патогенов, такая молекулярная торговля между микобактериями еще не была четко описана. Метаболическая диверсификация среди клональной популяции является одной из ключевых стратегий для создания гетерогенных субпопуляций для выживания даже в условиях нестабильности питательных веществ. Каждая гетерогенная субпопуляция может быть специализирована на производстве определенных важных молекул, необходимых для выживания. Поэтому каждая субпопуляция микобактерий должна зависеть друг от друга для своего выживания. Субпопуляция бактерий становится метаболически неактивной, что позволяет повысить их приспособленность. Такие неактивные бактериальные клетки получают преимущества от близлежащих белков вирулентности, которые производят активные клетки, не вкладывая средства в производство таких белков вирулентности.
Разделение труда может быть общей чертой сообщества микобактерий, где одно подмножество клеток может производить вирулентные эффекторы для подрыва иммунной системы хозяина, в то время как другое подмножество популяции может производить молекулы для получения необходимых питательных веществ на благо всей популяции. В ответ на микросреду гетерогенной гранулемы подмножество живущих в ней микобактерий дифференцированно экспрессирует активируемые гранулемой гены, что подтверждает вышеупомянутую гипотезу.
Разделение труда
Микобактерии производят три различных сидерофора, включая микобактин и растворимые карбоксимикобактин и экзохелин, чтобы эффективно утилизировать молекулы железа. Чтобы снизить метаболическую нагрузку, микобактерии перерабатывают сидерофоры вместо того, чтобы синтезировать новые молекулы сидерофора. Также обнаружено, что наличие большого количества сидерофоров как во внутриклеточной, так и во внеклеточной среде является токсичным для микобактерий, дефектных по переработке сидерофоров. Можно предположить, что рециклинг сидерофоров у микобактерий может способствовать их обмену сидерофорами с местным сообществом.
Мембранные везикулы (МВ) также играют важную роль в межбактериальной коммуникации. В условиях недостатка железа in vitro в Mtb индуцируется продукция микобактинсодержащих МВ, а микобактин, связанный с этими МВ, служит хелатором железа и поддерживает рост бактерий. МВ из Mtb, выращенных в среде с дефицитом железа, обеспечивают рост Mtb, дефектных по выработке микобактина (ΔmbtB), что позволяет предположить, что МВ распространяются среди микобактерий в местном сообществе.
Миколактон - токсин, необходимый для развития некротических кожных поражений. В микобактериальных биопленках в изобилии обнаружены МВ, несущие миколактон, что указывает на то, что миколактон служит продуктом кооперативного поведения, который также защищает другие подгруппы бактерий от иммунной системы хозяина. Еще одним правдоподобным доказательством кооперативного поведения микобактерий является их реанимация из состояния покоя. Известно, что факторы, способствующие возрождению (Rpfs), проявляют гидролизующую активность клеточной стенки и, таким образом, участвуют в реанимации спящих клеток микобактерий. Такие ферменты ремоделирования клеточной стенки, вероятно, функционируют аналогично межбактериальным сигнальным ферментам, где Rpfs генерируют фрагменты пептидогликана, которые действуют как сигнальные молекулы для активации процесса реанимации в спящих микобактериях. Возможно, реанимация не связана строго с клетками, продуцирующими Rpfs; однако непродуценты в местном сообществе также могут получать преимущества, получая такие сигналы для реактивации.
В ответ на относительную доступность углерода и азота микобактерии растут либо в виде крупных агрегатов, либо в виде планктонных клеток. Микобактерии агрегируют в специфический узор, имитирующий нити; это явление известно как образование нитей. Было установлено, что агрегация, грубая морфология и длительная персистенция микобактерий в макрофагах сильно коррелируют между собой. Шероховатый морфотип M. abscessus образует сгустки за счет тесного межклеточного взаимодействия, что позволяет им эффективно уничтожать макрофаги, тогда как гладкий морфотип остается в виде изолированных бацилл и не способен уничтожить макрофаги, что свидетельствует о том, что микобактериальные клетки как сообщество могут эффективно подрывать иммунную систему хозяина за счет внутреннего взаимодействия.
Инфекция шероховатыми (Rg) Mycobacterium avium вызывала тяжелую пневмонию и повышенную цитотоксичность у мышей и макрофагов, соответственно. Когда макрофаги инфицировались Rg, бациллы агрегировали, и экспрессия провоспалительных цитокинов, таких как TNFα и IL-6, увеличивалась. Однако Rg не могли вызывать секрецию провоспалительных цитокинов или цитотоксичность, когда они были дезагрегированы, что указывает на то, что для проявления высокой вирулентности необходимо внутреннее взаимодействие клетки с клеткой.
Выступающие на поверхности гликопептидолипиды (ГПЛ) являются внешними компонентами микобактерий, которые маскируют связанные с клеточной стенкой липиды. Микобактерии демонстрируют грубую морфологию, когда они теряют несколько поверхностно-выраженных ГПЛ из-за снижения регуляции или мутации путей биосинтеза ГПЛ. Отсутствие или сниженная экспрессия ГПЛ обнажает липиды клеточной стенки микобактерий и тем самым вызывает иммунный ответ.
Гладкий вариант Mycobacterium abscessus часто наблюдается внутри фагосомы в виде одиночных бактерий, тогда как вариант Rg был обнаружен в виде группы внутри фагосомы, содержащей рыхлую мембрану. Несмотря на то, что индуцированный хозяином стресс преобладает в фаголизосомах, Rg-вариант быстро размножается и ослабляет защитный механизм макрофагов, что приводит к аутофагии и апоптозу, что указывает на то, что сложная коммуникация между микобактериями способствует гипервирулентной активности.
Также сообщалось, что агрегаты Mtb могут распространяться через биоаэрозоли. Наличие агрегатов Mtb вокруг полостных поражений легких у больных туберкулезом указывает на то, что гипервирулентные агрегаты Mtb могут передаваться от человека к человеку и вызывать усиление воспаления и гибель клеток, что приводит к активному заболеванию. Инфицирование клеток термически обработанными агрегатами Mtb не показало значительной гибели клеток, что говорит о том, что живые микобактерии интенсивно общаются друг с другом и обмениваются молекулярной информацией, чтобы стимулировать вирулентность в организме хозяина.
Микобактериальные биопленки функционируют как общее убежище для кооперативных фенотипов, в которых также ассимилируются многочисленные генотипы, включая микобактерии, дефектные в образовании биопленки, и таким образом между бактериальными клетками устанавливается межклеточная коммуникация посредством взаимодействия "клетка-клетка" для обмена биомолекулами. Таким образом, биопленки также служат общим убежищем для местного сообщества.
Молекулярная торговля между микобактериями
Микобактерии устанавливают связь с соседними бактериями для обмена многочисленными фрагментами ДНК посредством уникального процесса горизонтального переноса генов (ГПГ), который отличается от классической конъюгации, опосредованной oriT, что обеспечивает эволюционную пригодность бактерий для адаптации во враждебной среде. Перед началом взаимодействия бактерии должны обнаружить подходящих партнеров. Исследования нокаута генов показали, что системы секреции VII типа (ESX-системы) в основном необходимы для межбактериальной коммуникации. На основе филогенетического и сравнительного геномного анализа было установлено, что микобактерии эволюционируют и имеют различные системы ESX в следующем порядке: ESX-4, ESX-1, ESX-3, ESX-2 и ESX-5.
Хотя микобактерии имеют пять T7SS, каждая система ESX заслуживает уникальных функций, что подразумевает, что одна система ESX не будет дополнять другие системы ESX из-за их различных сигналов секреции и дифференциальных путей регуляции. В поддержку этого, ГПГ между микобактериями происходит через взаимодействие между системами ESX-1 и ESX-4, что предполагает, что взаимодействие между системами ESX, вероятно, происходит для поддержания бактериальной физиологии. Крайне важно, чтобы взаимодействие микобактерий не происходило между случайными клетками, тогда как микобактерии, обладающие локусом mid, кодируемым геном mid, придают идентичность спариванию. Трансконъюганты становятся донорами, если донор-конфигурирующий mid-локус также передается реципиентам.
Как только клетки-реципиенты воспринимают сигнал от клеток-доноров, в реципиентах происходит ряд молекулярных событий для приобретения молекул. Например, посредством неизвестных сигналов, как только клетки-реципиенты распознают клетки-доноры, трансмембранный анти-SigM инактивируется, что в свою очередь высвобождает экстрацитоплазматический транскрипционный фактор SigM, который активирует систему ESX-4, что приводит к модуляции экспрессии генов, способствующей ГПГ.
ESX-1 также играет важную роль в межбактериальной коммуникации. Например, клетки-доноры, дефектные по ESX-1, становятся гиперконъюгативными, а клетки-реципиенты, дефектные по ESX-1, не могут успешно получать ДНК от доноров. При взаимодействии с соседними клетками-донорами в клетках-реципиентах происходит регуляция транскриптов esxUT, опосредованная ESX-4, тогда как в монокультуре донора или реципиента такой индукции транскриптов esx4 не наблюдается, что позволяет предположить, что ESX-4 также критически вовлечен в межбактериальное взаимодействие.
Анализ РНК-секвенирования кокультур показал, что помимо генов, необходимых для ГПГ, модулировалась экспрессия многих других генов, что говорит о том, что при взаимодействии между клетками донора и реципиента происходит множество молекулярных событий. Поскольку SigM и ESX-4-опосредованная сигнальная система является консервативной для всех микобактерий, такая сеть взаимодействия может быть активным процессом у разных видов микобактерий. Можно сделать вывод, что esxUT клеток-реципиентов можно использовать в качестве биомаркера межклеточной коммуникации.
Молекулярная торговля между бактериями может кардинально изменить молекулярный пул микобактерий путем прямого приобретения чужеродных молекул, что, в свою очередь, может повлиять на колонизированную нишу и исход инфекции в организме хозяина. Хотя структурные компоненты ESX-1 одинаково существуют у разных видов микобактерий, их секреторный репертуар может быть различным у разных видов, и даже может быть видоспецифичным, что дает представление о том, что ESX-1 определяет морфологию клеточной поверхности микобактерий для распознавания клеток. Таким образом, молекулярная торговля в рамках ГПГ хорошо изучена у микобактерий. Однако идентификация других обменивающихся молекул может дать более глубокое понимание физиологии микобактерий.
Формирование биопленки
Микобактерии могут выживать в организме хозяина в течение длительного периода времени, в том числе в составе биопленки. Биопленка - это типичная организованная структура, в которой обитает гетерогенная бактериальная популяция, взаимодействующая кооперативно для получения и совместного использования ресурсов. Микобактерии создают такую биопленку в ответ на воздействие окружающей среды, такое как осмолярность, доступность питательных веществ, pH, кислород и концентрация CO2.
Образование биопленки можно рассматривать как проявление скоординированного поведения, которое происходит как у туберкулезных, так и у нетуберкулезных микобактерий, включая Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium smegmatis, Mycobacterium marinum, Mycobacterium fortuitum, Mycobacterium chelonae, Mycobacterium ulcerans, M. abscessus, M. avium и Mycobacterium bovis, подтверждая, что в микобактериях происходит коммуникация "клетка-клетка". Биопленки нетуберкулезных микобактерий были обнаружены на различных поверхностях окружающей среды, включая медицинские приборы, зубные кариозные полости, мембранные фильтры и системы питьевой воды.
Взаимодействие между клетками является необходимым условием для формирования биопленки, причем такое взаимодействие зависит от множества факторов. Бактерии эффективно взаимодействуют друг с другом, если они присутствуют в нише в агрегированной форме. Грубые морфотипы M. abscessus образуют биопленки, придающие резистентность к антибиотикам. Lsr2 - это неспецифический ДНК-связывающий белок, который необходим в клетках-донорах, но не в клетках-реципиентах для успешного процесса переноса ДНК. Микобактерии, дефектные в производстве Lsr2, демонстрируют измененную морфологию колоний и мутантов в образовании биопленок. Кроме того, Lsr2 Mtb регулирует гены, участвующие в адаптации в условиях гипоксии, подразумевая, что Lsr2 является ключевым регулятором, необходимым для проявления многоклеточного поведения.
Электронно-микроскопические исследования полости легких пациентов, инфицированных M. abscessus, показали, что микобактерии существуют внутри матричной биопленки, что свидетельствует о том, что микобактерии могут эффективно формировать биопленки в условиях in vivo. Окрашивание мокроты больных НТМ кислотой показало наличие биопленочных агрегатов (Qvist et al., 2015). Возможно, что нестерилизованные очаги способствуют формированию биопленок in vivo, способствуя прогрессированию хронической инфекции.
В полости легких пациента содержится высокая доля микобактерий наряду с различными видами бактерий, что указывает на то, что различные штаммы Mtb могут существовать как сообщество в смешанных биопленках in vivo. Агрегированные микобактериальные клетки на дне жидкой среды не способны обмениваться ДНК от донора к реципиенту, что позволяет предположить, что биопленка не только служит платформой для облегчения переноса ДНК, обеспечивая физический контакт клетки с клеткой, но и обеспечивает другие необходимые условия для переноса ДНК. Кроме того, для уточнения механизма необходимы молекулярные доказательства. Появление лекарственно резистентных микобактерий in vivo, возможно, связано с образованием биопленок. Таким образом, лекарственная резистентность является отличительной чертой микобактерий, живущих в биопленке. Существование микобактерий как сообщества внутри биопленки может быть фактом повышенной лекарственной резистентности.
В гранулематозных поражениях микобактерии сталкиваются с несколькими экологическими стрессами, включая гипоксию, изменение рН, питательное голодание, реактивные виды кислорода и азота, факторы, нарушающие клеточные мембраны, токсичные липидные компоненты и другие факторы. Для адаптации к такой суровой среде микобактерии используют 11 двухкомпонентных регуляторных систем (TCS). Микобактерии используют такие TCS для регуляции физиологических и метаболических процессов, включая деление клеток, реакцию на стресс и вирулентность. Роль TCSs в физиологии микобактерий подробно рассмотрена в других источниках (Bretl et al., 2011).
Межвидовое взаимодействие
Считалось, что микобактерии присутствуют внутри гранулемы, но они также были обнаружены в виде внеклеточных микроколоний вне гранулематозных поражений. Такие внеклеточные бактерии признаны персистирующими, которые служат источником реактивации. Пациенты с муковисцидозом инфицированы несколькими патогенами, при этом вероятно взаимодействие между внеклеточными бактериями за пространство и питательные вещества. Pseudomonas aeruginosa и Aspergillus spp. были обнаружены в большом количестве в образцах мокроты пациентов с муковисцидозом, у которых были зарегистрированы НТМ-инфекции (Levy et al., 2008).
В другом исследовании была обнаружена положительная корреляция между НТМ-инфекцией и Staphylococcus aureus, но в то же время обратная корреляция между НТМ и обилием P. aeruginosa (Olivier et al., 2003) указывает на возможность межвидовой коммуникации. Во время активной фазы туберкулеза выделяются миллионы туберкулезных палочек, которые могут взаимодействовать с другими видами бактерий для подрыва иммунной системы хозяина. Соответственно, исследователи также обнаружили, что микобактерии могут модулировать патогенез сосуществующих P. aeruginosa и S. aureus. Например, микобактерии могут влиять на механизмы QS Pseudomonas sp., разрушая их сигналы QS с помощью PQS-диоксигеназы и фосфотриэстеразоподобных лактоназ. Аналогичным образом, Mycobacterium fortuitum модулирует формирование биопленки P. aeruginosa, вырабатывая пиоцианин деметилазу (PodA), которая деградирует феназины, тем самым ингибируя пиоцианин-зависимое высвобождение внеклеточной ДНК.
Таким образом, микобактерии используют несколько путей для воздействия на механизмы QS P. aeruginosa. Хотя межвидовые взаимодействия хорошо определены у других видов бактерий, у микобактерий такие взаимодействия изучены недостаточно. Более того, взаимодействие между медленно растущими микобактериями и быстрорастущими P. aeruginosa до сих пор остается весьма спорным. Для подтверждения этих выводов необходимы дальнейшие исследования in vivo.
Коммуникация клетка-клетка
Поскольку ГПГ происходит контактно-зависимым образом как у быстро-, так и у медленнорастущих микобактерий, можно предположить, что такое взаимодействие может преобладать во всем роде. Постоянное взаимодействие между клетками микобактерий либо на твердой среде, либо внутри биопленки способствует осуществлению ГПГ, тогда как между мобилизующимися клетками ГПГ не происходит. Кроме того, ГПГ не происходит, если клетки-доноры и клетки-реципиенты физически разделены с помощью трансвеллов, что указывает на то, что для обмена генетическим материалом и эволюции микобактерий необходим контакт клетка-клетка.
Предыдущие исследования показали, что обмен генетическим материалом между микобактериями не происходит за счет трансдукции или слияния или трансформации клеток, что позволяет предположить существование каких-то специализированных механизмов для обмена биомолекулами между клетками микобактерий (Parsons et al., 1998). Однако межклеточная коммуникация между видами микобактерий через специализированные физические структуры до сих пор остается неизученным явлением. Поскольку богатая гидрофобными липидами клеточная стенка препятствует доступу к ДНК для трансформации, постулируется, что ГПГ происходит в микобактериях через специализированные структуры (Gray and Derbyshire, 2018).
Интересно, что исследования электронной микроскопии показывают, что различные виды микобактерий, включая Mycobacterium paratuberculosis, M. avium, Mycobacterium intracellulare, M. bovis, M. tuberculosis, M. marinum, Mycobacterium phlei и Mycobacterium xenopi, производят полые внеклеточные нити. Более того, было замечено, что в старых культурах микобактерий образуется больше внеклеточных филаментов. Эти структуры назывались по-разному: пили, фибриллы или просто внеклеточные нити. Несмотря на глубокое понимание генома микобактерий и имеющиеся биохимические и структурные данные, функциональное значение этих микобактериальных филаментов остается неустановленным. Следовательно, глубокое понимание микобактериальных филаментов может дать представление о размерах, химическом составе и функциональности.
Последние молекулярные данные достигли определенных успехов в расшифровке таких филаментов. Например, Mtb продуцирует EspC, который мультимеризуется и самособирается в удлиненную филаментоподобную структуру, необходимую для экспорта EsxA (Ates and Brosch, 2017; Lou et al., 2017). Поскольку ESX-4 жестко регулирует коммуникацию клетка-клетка, можно предположить, что секретируемые молекулы Esx-4 могут функционировать как строительные блоки для формирования трубчатой структуры для обмена молекулами между микобактериями.
Тем не менее, на сегодняшний день нет сообщений о специализированных физических структурах для установления связи между штаммами микобактерий. Из-за толстой гидрофобной микомембраны клеточная стенка микобактерий считается крайне непроницаемой, что дает основание предполагать существование специализированных секретирующих механизмов для переноса молекул.
Опосредованная нанотрубками коммуникация
В ряде исследований сообщалось, что различные виды бактерий, включая Bacillus subtilis, Bacillus megaterium, S. aureus и E. coli, производят нанотрубки, которые образуют сеть между клетками для межклеточного обмена цитоплазматическими молекулами, такими как аминокислоты, токсины, белки и неконъюгативные плазмиды, что дает основание полагать, что рассмотренные выше внеклеточные филаменты микобактерий, вероятно, являются каналами для транспортировки цитоплазматических молекул между клетками.
Когда соседние клетки в изобилии присутствуют в нише, бактерии устанавливают связь через сеть нанотрубок; однако бактерии производят вытянутые нанотрубки и в отсутствие соседей. В условиях недостатка питательных веществ образование нанотрубок индуцируется среди бактерий, чтобы облегчить перемещение питательных веществ к нужным бактериям. Кроме того, взаимодействие между ауксотрофом и клетками-донорами (производителями аминокислот) через нанотрубки приводит к перепроизводству аминокислот в клетках-донорах, необходимых для ауксотрофа, тем самым отсрочивая торможение обратной связи в клетках-донорах. Таким образом, нанотрубки дают бактериям селективные преимущества для адаптации к изменяющейся среде.
Согласно этим данным, образование нанотрубок у бактерий, скорее всего, необходимо для преодоления дефицита питательных веществ. Недавно было установлено, что каналообразующие мембранные интегрированные белки (FliO, FlioP, FliQ, FliR, FlhB и Flh), называемые CORE, необходимы для синтеза нанотрубок (Bhattacharya et al., 2019). Анализ in silico показал, что такой комплекс CORE широко распространен в различных бактериальных филах, включая актинобактерии. Поскольку микобактерии относятся к филу актинобактерий, это может свидетельствовать о том, что микобактерии, скорее всего, обладают таким механизмом для синтеза нанотрубок.
Бактерии используют фермент ремоделирования клеточной стенки LytC и его активатор LytB для экструзии нанотрубок из клеток-доноров и проникновения в клетки-реципиенты. Известно, что микобактерии содержат несколько ферментов ремоделирования клеточной стенки, которые могут быть вовлечены в создание сети микобактериальных нанотрубок. Например, у M. smegmatis есть белок деления мембраны iniA, который участвует в ремоделировании мембраны. При физическом взаимодействии микобактерий SigM напрямую регулирует экспрессию нескольких генов, включая аппарат ESX-4, гидролазу клеточной стенки и нуклеазу, что подтверждает участие SigM и ESX-4 в экструзии и проникновении нанотрубок микобактерий через активацию гидролазы клеточной стенки. Повышение уровня амидазы пептидогликана (Rv0024) в M. smegmatis вызывает взаимодействие между клетками, что приводит к увеличению образования биопленки, которая, в свою очередь, повышает уровень резистентности к антибиотикам, что позволяет предположить, что взаимодействие между клетками существует внутри микобактериальной биопленки, возможно, через сеть нанотрубок.
Контактно-зависимое взаимодействие происходит не только между клетками микобактерий, но и между клетками хозяина. Например, Mtb использует систему ESX-1 для разрыва мембраны клетки хозяина контактно-зависимым образом, что способствует успешной колонизации хозяина. Однако не удалось показать трубкоподобные структуры, соединяющие бактерии и клетки хозяина. Тем не менее, в недавнем исследовании был продемонстрирован механизм, с помощью которого инвазированные хозяином E.coli получают питательные вещества из клеток хозяина через нанотрубки (Pal et al., 2019). Восприятие сообщений через МВ может быть одним из методов коммуникации микобактерий. Микроскопический анализ показал, что B. subtilis, вероятно, производят МВ из нанотрубок посредством механизма отщепления (Dubey et al., 2016).
Контактно-независимое взаимодействие
В ответ на стресс или голодание бактерии вырабатывают алармон (p)ppGpp, который регулирует несколько процессов, включая формирование биопленки, вирулентность, выживание и персистенцию. Rel является ферментом алармонсинтетазы/гидролазы, который производит (p)ppGpp путем гидролиза C-di-GMP или переноса пирофосфата из АТФ в GDP. При заражении мышей H37RvΔrelMtb устойчивая хроническая инфекция нарушается, что говорит о том, что RelMtb сильно модулирует экспрессию компонентов, участвующих в латентной инфекции. Удаление Rel в M. smegmatis привело к изменению компонентов клеточной стенки, снижению длительного выживания и повышению уязвимости к гипоксии и питательному голоданию.
Для того чтобы успешно противостоять стрессам, генерируемым хозяином, микобактерии осуществляют ряд интенсивных реакций, которые связаны с экспрессией генов вирулентности, лекарственной резистентностью, персистенцией и латентностью. Mtb, лишенные RelMtb, бесконтрольно реплицируются при недостатке питательных веществ, как и бактерии дикого типа, и не могут перейти в состояние покоя. Mtb, лишенные RelMtb, более чувствительны к лечению изониазидом во время питательного голодания и в легких инфицированных мышей. Таким образом, гомеостаз (p)ppGpp необходим во время хронической инфекции у животных для регулирования метаболизма и вирулентности в условиях стресса, опосредованного хозяином.
Другое косвенное доказательство также предположило наличие системы QS у микобактерий. Оно показало, что экспрессия предполагаемого транскрипционного регулятора (whiB3) зависит от плотности бактерий, что отражает возможное существование механизма QS. Микобактерии преодолевают стресс, опосредованный хозяином, с помощью Whib3, который перепрограммирует метаболическую активность в ответ на окислительный, восстановительный и нитрозативный стрессы.
В результате изучения сравнительной геномики было обнаружено, что многочисленные белки Mtb связаны с механизмами QS (Hegde, 2020). Транскрипционный регулятор LuxR является компонентом цепи QS, который контролирует экспрессию нескольких генов, включая гены, кодирующие биолюминесценцию, факторы вирулентности и формирование биопленки. Анализ секвенирования показал, что в геноме Mtb обнаружено семь белков семейства LuxR, таких как Rv0386, Rv0195, Rv0491, Rv0890c, Rv0894, Rv2488c и Rv3133c. Сигнал QS, такой как аутоиндуктор-2 (AI-2), вызывает окислительный стресс, который, в свою очередь, вызывает образование биопленки у M. avium, что позволяет предположить, что AI-2 может быть распознан микобактериями, что дает возможность для последующих событий QS. Анализ in silico показал, что Mtb обладает геном, имеющим 59% гомологии и 41% идентичности с LuxS, который отвечает за производство AI-2. Как и AI-2, активность диффузного сигнального фактора (DSF) была обнаружена у различных видов микобактерий, включая M. avium, M. chelonae, M. smegmatis, M. intracellulare и Mycobacterium kansasii.
Таким образом, микобактерии, предположительно, осуществляют контактно-зависимые и контактно-независимые взаимодействия одновременно.
Заключение и будущие перспективы
В свете результатов нескольких исследований можно сделать вывод, что микобактерии также осуществляют межбактериальную коммуникацию. Однозначно, микобактерии также обнаруживают и реагируют на соседние клетки, которые могут быть как их клонами, так и другими видами бактерий. Несмотря на существование гетерогенной популяции, микобактерии демонстрируют многоклеточное поведение в условиях in vivo, при котором каждое подмножество клеток самостоятельно распределяет работу (разделение труда), а не производит все необходимые молекулы, чтобы снизить метаболическую нагрузку. Фактически, межклеточная коммуникация является неотъемлемой частью эволюции микобактерий и увеличения их богатого разнообразия.
При рассмотрении важности межбактериальной коммуникации для обмена генетическим материалом возникает много интересных вопросов. Обмениваются ли микобактерии с соседними клетками какими-либо другими цитоплазматическими молекулами, такими как белки, РНК, токсины, питательные вещества и плазмиды? Существование нескольких подмножеств популяции микобактерий в месте локализации инфекции, интригует предположением, что одно подмножество клеток обеспечивает резистентность к определенным антибиотикам, в то время как другие подмножества клеток производят какие-то другие белки, способствующие резистентности к антибиотикам. Частые случаи неудач в антибиотикотерапии могут быть связаны с обменом молекулами, придающими резистентность, между популяциями. Сосуществование обоих подтипов, однако, приносит пользу всей популяции во время антибиотикотерапии. Обмен антибиотикоустойчивыми белками/мРНК между различными генотипами B.subtilis хорошо документирован (Dubey and Ben-Yehuda, 2011). Реакция микобактерий на AI-2 предполагает наличие общих для всех видов микобактерий механизмов QS, которые могут контролировать несколько жизненно важных процессов в микобактериях.
Поскольку белки вирулентности имеют решающее значение во время инфекции, крайне важно найти факторы, контролирующие/регулирующие экспрессию этих белков. Следовательно, понимание регуляторных путей может дать представление о молекулярной природе микобактериальной инфекции (т.е. туберкулеза и проказы). Ключевые регуляторные белки механизмов QS могут быть использованы в качестве мишени для контроля патогенеза. Как уже упоминалось ранее, ключевые белки, сохранившиеся у разных видов микобактерий, могут быть вовлечены в механизмы QS различных видов микобактерий, которые могут быть использованы в качестве общей мишени для контроля различных микобактериальных заболеваний. Аналоги сигналов QS могут быть использованы в качестве конкурентных ингибиторов для ослабления механизмов QS, и таким образом вирулентность микобактерий может быть подавлена в процессе патогенеза. Более того, выявление препаратов, специфически нацеленных на ключевые регуляторные белки механизмов QS, может стать потенциальным подходом для разработки лекарственных препаратов.
