Эффективное противомикробное лечение зависит от точной идентификации возбудителя и его чувствительности к антибиотикам, определяемой с помощью тестов на чувствительность к противомикробным препаратам (АСТ).
Однако АСТ часто оказываются неадекватными для выявления редких резистентных клеток среди преимущественно чувствительной популяции. Это ограничение особенно очевидно для бактериальных изолятов, которые демонстрируют фенотипическую гетерогенность отдельных клеток, обусловленную такими явлениями, как толерантность, персистенция и гетерорезистентность. Особое значение имеет гетерорезистентность (HR) - фенотип, характеризующийся наличием небольших субпопуляций резистентных бактерий в основной чувствительной популяции, частота которых может повышаться при воздействии антибиотиков.
Гетерорезистентность - это медицинский фенотип, при котором небольшие субпопуляции, резистентные к антибиотикам, сосуществуют внутри преимущественно чувствительных бактериальных популяций. Гетерорезистентность снижает эффективность лечения различных видов бактерий и классов антибиотиков, однако ее генетические и физиологические механизмы остаются малоизученными. HR наблюдается у различных видов бактерий и классов антибиотиков и может приводить к клиническим осложнениям, когда резистентная субпопуляция отбирается во время антимикробного лечения. Такие резистентные субпопуляции встречаются с низкой частотой (обычно от 10-7 до 10-4), что затрудняет выявление HR с помощью стандартных методов АСТ. Распространенность HR варьирует от необнаруживаемых уровней до >50% в зависимости от вида бактерий и конкретного антибиотика.
HR может быть результатом нескольких типов механизмов, включая точечные мутации, которые увеличивают минимальную ингибирующую концентрацию (МИК) в субпопуляции клеток. В зависимости от того, какой ценой достаются эти мутации, они вызывают либо нестабильные (возвращаются к чувствительности), либо стабильные (не возвращаются к чувствительности) фенотипы HR. Другим распространенным механизмом, ответственным за формирование резистентных субпопуляций, является тандемная амплификация генов, когда увеличение количества генов резистентности приводит к повышению МИК, потенциально достигая клинических уровней брейкпойнтов.
Однако такие амплификации обычно быстро утрачиваются в отсутствие антибиотикоселекции, что приводит к возврату к чувствительности к антибиотикам и нестабильному HR-фенотипу. Это может произойти после смены терапии или во время рутинных клинических лабораторных манипуляций, что затрудняет объяснение неудач в лечении HR. Образование тандемных амплификаций зависит от конкретных генетических условий, включая наличие прямых повторов, фланкирующих ген резистентности, которые служат субстратом для первоначального события дупликации. У Enterobacteriaceae и других видов бактерий гены резистентности и повторяющиеся последовательности (часто IS-элементы или гены транспозазы) часто располагаются на больших плазмидах с низким числом копий.
В предыдущем исследовании мы наблюдали небольшое (в 2-3 раза) увеличение числа копий плазмид, несущих гены резистентности, в антибиотикорезистентных мутантах, полученных из двух HR-изолятов Klebsiella pneumoniae, выделенных в присутствии аминогликозидов. В данном исследовании мы сосредоточили внимание на специфическом клиническом изоляте K. pneumoniae с β-лактамазами расширенного спектра (ESBL) в качестве модельного организма и тщательно изучили различные механизмы HR, связанные с увеличением числа копий генов, а не с точечными мутациями.
Наше внимание к механизмам генерации HR путем увеличения числа копий генов было мотивировано предыдущими работами, показавшими, что тандемные генетические амплификации являются основными механизмами HR у грамотрицательных бактерий. K. pneumoniae является одним из основных нозокомиальных патогенов, вызывающих широкий спектр инфекций, которые часто приводят к увеличению заболеваемости и смертности. Объединив обширные геномные и фенотипические данные, мы выявили три параллельных механизма HR, приводящих к увеличению числа копий генов резистентности, высокому уровню резистентности и даже к увеличению размера генома в три раза.
Используя модель колонизации кишечника мыши, мы продемонстрировали потенциальное влияние увеличения числа копий генов резистентности на результаты лечения, тем самым впервые установив прямую связь таких механизмов с гетерорезистентностью in vivo. Наконец, анализ коллекции HR изолятов Escherichia coli показал, что все три механизма также распространены и у этого вида. Все три механизма налагают фитнес-издержки и являются генетически нестабильными, что приводит к быстрому возврату к чувствительности в отсутствие антибиотиков. Важно отметить, что эти три механизма преобладают среди изолятов Escherichia coli из кровотока. Полученные нами данные подчеркивают необходимость разработки стратегий лечения, учитывающих сложное взаимодействие плазмид, кассет резистентности и транспозонов в бактериальных популяциях.
