Симбиотические отношения между кишечной микробиотой и хозяином способствуют ферментации пищи, защите от патогенов, развитию иммунной системы и т. д..
Сложно определить «здоровую» микробиоту кишечника, поскольку ее состав сильно варьирует у разных людей, в зависимости от расположения в желудочно-кишечном тракте и претерпевает изменения в процессе старения. Однако известно, что дисбиоз микробиоты кишечника, вызванный, например, инфекциями, изменениями в питании или приемом лекарств, может нарушать функции организма и способствовать развитию различных заболеваний. Например, многочисленные исследования показали различия между микробиомами кишечника здоровых людей и пациентов с воспалительными заболеваниями кишечника (ВЗК).
Несмотря на то, что остаются вопросы о причинно-следственной связи, исследования показали ассоциацию между ВЗК, дисбиозом микробиоты, иммунной системой и целостностью кишечного барьера. Кроме того, начиная с 1990-х годов, когда была обнаружена связь между инфекцией Helicobacter pylori и развитием рака желудка, дисбиоз микробиоты связывают с опухолевым генезом. С тех пор несколько видов бактерий ассоциируются с развитием и прогрессированием рака. Более того, исследования раковых пациентов, получающих иммунотерапию, подчеркивают важность состава микробиома для мощного противоопухолевого ответа.
Некоторые представители кишечной микробиоты хронически активируют иммунную систему, что приводит к выработке плазматическими клетками антиген-специфических IgA. По оценкам, ~80% IgA-продуцирующих плазматических клеток в организме находятся в слизистой оболочке кишечника, где они вырабатывают 40-60 мг/кг/сут димерного IgA в стабильных условиях. Вырабатываемый высокоаффинный IgA секретируется в просвет кишечника, где он связывает, или «покрывает», бактерии, инициировавшие иммунный ответ. Более широкий спектр комменсалов также может покрываться IgA неканоническим способом, который, как полагают, обладает более низкой аффинностью и специфичностью. По приблизительным оценкам, у здоровых людей 10-50% кишечных бактерий покрыты IgA, что необходимо для гомеостаза и здоровья кишечника, а также может способствовать микробному разнообразию кишечника. Популяционные исследования выявили дефицит IgA как фактор риска развития аутоиммунных заболеваний, включая ВЗК. Кроме того, реакция IgA на микробиоту кишечника ассоциируется с другими заболеваниями, включая рассеянный склероз, астму и аллергию.
Мы не до конца понимаем, почему определенные виды бактерий покрываются IgA. Однако сообщается о различных последующих эффектах покрытия IgA, включая предотвращение или содействие колонизации бактерий и изменение экспрессии бактериальных генов. Интересно, что во время воспаления процент бактерий, покрытых IgA, увеличивается до 90%. Чтобы полностью понять биологию бактерий, покрытых IgA, и их роль в здоровье и заболеваниях человека, нам нужны новые инструменты для изучения этих бактерий.
Современный, наиболее часто используемый метод изучения IgA-покрытых бактерий был первоначально разработан Palm и De Zoete et al. и известен как IgA-SEQ. Этот метод сочетает в себе флуоресцентно-активированную сортировку клеток (FACS) бактерий, покрытых IgA, с секвенированием гена 16S рРНК для выявления иммуностимулирующих бактерий. Этот метод оказался успешным в расширении наших представлений о бактериях, покрытых IgA, и их роли в развитии заболеваний. Например, с помощью этой технологии было показано, что бактерии с высоким содержанием IgA способствуют развитию кишечных заболеваний и могут усугублять химически индуцированный колит у безмикробных мышей. Кроме того, IgA-SEQ был проведен в образцах стула большой когорты пациентов с ВЗК для выявления предикторов прогрессирования ВЗК.
Выявляя иммуностимулирующие бактерии у пациентов с ВЗК и периферическим спондилоартритом, IgA-SEQ позволил обнаружить ключевых игроков, связывающих мукозальное и TH17-зависимое воспаление, что дало представление о механизме этого распространенного внекишечного проявления у пациентов с ВЗК. IgA-SEQ также использовался для изучения других типов микробиоты человека, включая микробиоту носа, ротовой полости, колострума и зрелого человеческого молока. На основе оригинального метода IgA-SEQ Jackson et al. разработали пакет IgAScores R, который помогает интерпретировать массивы данных IgA-SEQ, корректируя композиционную природу данных об относительной численности для точного количественного определения связывания IgA с таксонами.
К сожалению, существующий метод IgA-SEQ имеет определенные недостатки. FACS-сортировка - это длительный и малопроизводительный процесс. Кроме того, количество бактерий, которые можно отсортировать за разумное время, ограничено, что сужает возможности последующего применения до секвенирования гена 16S рРНК. Кроме того, процесс FACS-сортировки - довольно жесткий процесс, проходящий в аэробных условиях, что приводит к снижению выживаемости отсортированных анаэробных бактерий, исключая возможность культивирования этих бактерий in vitro.
Поэтому в данном исследовании мы разработали и проверили два новых подхода к IgA-SEQ, которые можно использовать в анаэробных условиях с высокой пропускной способностью. Мы систематически сравнивали оригинальный протокол IgA-SEQ на основе FACS с двумя подходами IgA-SEQ на основе магнитных 96-луночных планшетов и показали, что подход нового поколения IgA-SEQ (ng-IgA-SEQ) на основе магнитных 96-луночных планшетов является неизменно надежным в различных экспериментальных условиях, включая сортировку бактерий, покрытых IgA, из образцов человеческого кала. Кроме того, ng-IgA-SEQ позволил использовать новые, ранее недостижимые возможности для последующего применения: дробное метагеномное секвенирование бактерий с IgA-покрытием (благодаря возможности получения большего количества бактерий с IgA-покрытием) и культивирование бактерий с IgA-покрытием непосредственно из образцов фекалий (путем выделения бактерий с IgA-покрытием в анаэробных условиях).
Результаты
Мы показали на различных по сложности средах - от простых бактериальных смесей до образцов человеческих фекалий - что наш протокол ng-IgA-SEQ на основе магнитных 96-луночных планшетов высокоэффективен для сортировки и идентификации бактерий, покрытых IgA, с высокой пропускной способностью и экономией времени. Кроме того, мы провели сравнительный анализ различных протоколов IgA-SEQ, показав, что оригинальный подход IgA-SEQ на основе FACS упускает из виду некоторые нюансы бактерий с IgA-покрытием из-за низкого выхода отсортированных бактерий. Также, ng-IgA-SEQ на магнитной основе позволяет использовать новые возможности для последующего применения. Во-первых, в качестве доказательства концепции мы провели метагеномное секвенирование 10 образцов фекалий человека, чтобы выявить штаммы бактерий, покрытых IgA, и связанные с ними пути и CAZymes. Во-вторых, мы успешно выделили и культивировали бактерии с IgA-покрытием, выполнив протокол выделения в анаэробных условиях.
Выводы
Наша технология высокопроизводительного IgA-SEQ нового поколения на основе магнитных 96-луночных планшетов позволяет эффективно идентифицировать большое количество IgA-покрытых бактерий из образцов фекалий. Это открывает путь для анализа больших когорт, а также для новых последующих приложений, включая дробное метагеномное секвенирование, культуромику и различные функциональные анализы. Эти приложения необходимы для раскрытия роли иммуностимулирующих бактерий в здоровье и болезни.
