ПЦР: активируем светом
ДНК-полимеразы и другие ферменты, модифицирующие ДНК, являются важнейшими инструментами в биотехнологии и диагностике.
Они, в том числе, являются ключевым компонентом для диагностики COVID-19 методом ПЦР. Какими бы полезными они ни были, ферменты для обработки ДНК часто имеют существенные недостатки. Некоторые из них проявляют значительную активность во время подготовки образцов, другие обладают неприятной вторичной активностью. И то, и другое может привести к потере специфичности и чувствительности, чего необходимо избегать в диагностическом тесте. Хитрость заключается в том, чтобы блокировать любой вид ферментативной активности до начала анализа.
Для диагностических тестов на основе ПЦР, таких как вышеупомянутый тест на COVID-19, решением является разработка фермента "горячего старта", который не проявляет активности до достижения высокой температуры активации. Главный недостаток таких подходов заключается в том, что их нельзя использовать для ферментов, которые повреждаются под воздействием тепла, говорит биохимик Андрес Вера. "Кроме того, разработка фермента с горячим стартом утомительна, и этот изнурительный процесс приходится повторять для каждого нового фермента, который мы хотим создать".
Вера нашел способ обойти эти проблемы, создав ферменты со световым стартом, которые блокируются до тех пор, пока импульс ультрафиолетового света не активирует их. "Ферменты, управляемые светом, существуют уже довольно давно, но уникальность нашего подхода заключается в том, что его можно применить практически к любому ферменту, обрабатывающему ДНК. В прошлом всегда требовалась очень подробная информация о том, как работает ваш фермент, и вы никогда не были уверены, что вам удастся найти разумный способ блокировать фермент и реактивировать его с помощью света", - говорит Вера.
В своем подходе исследователи связали часть ДНК с самим ферментом, которая конкурирует с любыми другими ферментативными субстратами, делая фермент фактически неактивным (включая его вторичную активность). Световой импульс используется для разрезания ДНК, прикрепленной к ферменту, в результате чего получается 100% активный фермент. Главное преимущество заключается в том, что механизм должен работать для широкого спектра ферментов, связывающих ДНК, независимо от их специфического способа действия.
Чтобы доказать свою точку зрения, исследователи создали четыре светоактивируемые версии различных ферментов для обработки ДНК. Среди них была так называемая ДНК-полимераза Phi29 - фермент, широко используемый для амплификации целых геномов, но слишком чувствительный к нагреванию, чтобы его можно было адаптировать к методам горячего старта. Исследователи провели испытания ПЦР со световым стартом и доказали, что их ДНК-полимеразы не уступают или превосходят коммерческие ферменты для ПЦР с горячим стартом.
"Это определенно поможет производить лучшие ферменты для биотехнологического и диагностического использования", - отмечает Вера. "Кроме того, современные ПЦР-анализаторы в реальном времени уже включают в себя источники света, и их можно легко модифицировать, чтобы вывести эти ферменты на рынок в ближайшее время".
Инновационная технология описана в статье, опубликованной в Nucleic Acids Research.
