microbius
РОССИЙСКИЙ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЙ ПОРТАЛ
Поиск
rss

ООО "АЛИФАКС"

ИНН 7718314415

ID 2Vtzqx7tLnC

Реклама

ООО "АЛИФАКС"

ИНН 7718314415

ID 2VtzqwzYS9e

Реклама

ООО "АЛИФАКС"

ИНН 7718314415

ID 2VtzqvtsLHv

Реклама

Секвенирование РНК единичных клеток для изучения сальмонеллезной инфекции
Секвенирование РНК единичных клеток для изучения сальмонеллезной инфекции

Автор/авторы:
share
69
backnext
Сканирующая электронная микрофотография Salmonella Typhimurium, вторгающейся в эпителиальную клетку человека. Фото: NIAID.

У людей, заразившихся сальмонеллой, наблюдаются симптомы различной степени тяжести - многие страдают диареей и лихорадкой, в то время как у некоторых симптомы вообще отсутствуют.

   Что же определяет исход заболевания при сальмонеллезе? Здесь может действовать множество факторов, например, различия в штаммах сальмонелл, вызывающих инфекции, или вариации в генетическом строении или иммунных реакциях людей. Другими словами, не все клетки (хозяина или патогена) одинаковы или имеют схожую физиологию. Эти факторы могут привести к широкому клиническому спектру инфекций Salmonella.

   Сейчас ученые пытаются выявить эту неоднородность во взаимодействии хозяина и сальмонеллы, исследуя поведение отдельных клеток с беспрецедентным разрешением. "Это очень сложное исследование, поскольку количество бактерий на разных стадиях сальмонеллезной инфекции меняется поминутно. Поэтому нам нужны чувствительные инструменты для их исследования", - рассказывает профессор Рой Авраам, главный научный сотрудник отделения иммунологии и регенеративной биологии Института науки Вейцмана, во время сессии ASM Microbe 2022. Одним из методов, который достаточно чувствителен для изучения этих сложных взаимодействий, является секвенирование РНК (RNA-seq). Традиционное РНК-секвенирование позволяет определить средний транскриптом - уровень экспрессии различных генов в клетках - путем количественного определения мессенджерной РНК, или мРНК, в данном образце.

   В последнее десятилетие ученые раскрыли потенциал секвенирования РНК единичных клеток (scRNA-seq) для изучения взаимодействия хозяина и микроорганизмов. scRNA-seq предоставляет информацию о транскриптоме в единичных клетках, обеспечивая высокую пространственно-временную картину инфекционного ландшафта. Аналогия, которая часто упоминается в связи с одноклеточными методами, - это фруктовый коктейль: в то время как общие измерения могут дать информацию об основных характеристиках фруктового коктейля, одноклеточные технологии дают информацию об отдельных кусочках клубники, банана, яблока и так далее. Понимание того, какие гены повышены или понижены в отдельных клетках, позволяет понять, почему различные клетки ведут себя так, как они ведут себя. Разработка целенаправленной антимикробной терапии для лечения инфекций Salmonella с различными клиническими исходами остается главной целью такого углубленного понимания.

   Когда патоген инфицирует клетку хозяина, патоген активирует программу вирулентности, чтобы вызвать инфекцию, в то время как хозяин активирует защитный иммунный ответ для борьбы с захватчиком. На ход этого перетягивания каната может повлиять множество факторов. Например, когда и где патоген запускает свою программу вирулентности, или какие гены включаются или выключаются в инфицированных клетках в определенное время во время инфекции?

   Salmonella enterica серовар Typhimurium (S. Typhi) вторгается в клетки кишечника хозяина и начинает свой внутриклеточный жизненный цикл внутри фагоцитов, таких как макрофаги. При этом бактерия ускользает от иммунного ответа хозяина и впоследствии распространяется по всему организму через кровоток. Известно, что S. Typhi имеет неоднородную скорость репликации как в макрофагах, так и в тканях. Одна субпопуляция S. Typhi быстро растет и вырабатывает белки, которые взламывают клеточные механизмы хозяина, способствуя выживанию патогена. Эти белки вирулентности называются эффекторами и производятся двумя системами секреции III типа (T3SS), которые расположены на островах патогенности Salmonella Pathogenicity Island (SPI) 1 и 2. Между тем, вторая субпопуляция S. Typhi остается в виде нереплицирующихся клеток, называемых персистерами. Персистеры могут проявлять дальнейшую гетерогенность в зависимости от их метаболической активности. Они также резистенты ко многим антибиотикам и, следовательно, могут служить резервуаром для хронических инфекций. S. Typhi также проявляет гетерогенность во время инфекции в ответ на изменения иммунного ответа хозяина, что потенциально может перепрограммировать клеточный механизм хозяина на отдельные субпопуляции.

"Патоген сам влияет на иммунитет хозяина и находится под влиянием иммунитета. Ему приходится балансировать между своей репликацией, вирулентной активностью и манипуляцией иммунитетом хозяина", - объясняет Авраам.

   scRNA-seq макрофагов, инфицированных S. Typhi, показал, что активно делящиеся сальмонеллы находятся преимущественно в M2-подобных макрофагах, которые являются противовоспалительными и поддерживают рост бактерий. С другой стороны, нереплицирующиеся сальмонеллы находятся преимущественно в М1-подобных макрофагах, которые являются провоспалительными и останавливают рост бактерий. Персистирующие нереплицирующиеся сальмонеллы составляют меньшую субпопуляцию по сравнению с их быстрорастущими собратьями, но они имеют клиническое значение, поскольку резистентны к противомикробным препаратам.

   При отмене антибиотиков персистеры могут вызвать рецидив заболевания. Причина этого в том, что, хотя они не растут и не делятся, они все еще метаболически активны и способны перепрограммировать макрофаги через эффекторы вирулентности SPI-2. Это говорит о том, что вариации экспрессии генов в макрофагах хозяина могут создавать различные клеточные среды, которые могут влиять на патоген по-разному - либо позволяя сальмонеллам избегать иммунитета хозяина и выживать скрытно, либо позволяя им избегать антимикробной защиты хозяина и расти.

   Большинство исследований до сих пор использовали scRNA-seq для профилирования либо хозяина, либо патогена, но сейчас исследователи работают над одновременной оценкой клеток хозяина и патогена в рамках подхода, называемого двойным RNA-seq. Применение обширного двойного РНК-секвенирования в клетках хозяина, инфицированных Salmonella, показало, что бактериальная малая РНК под названием PinT манипулирует экспрессией многих генов хозяина и бактерий. PinT повышает уровень генов, вовлеченных в воспалительную сигнализацию в кишечнике хозяина - реакцию, от которой зависит, будет ли сальмонелла конкурировать с микробами кишечника и не погибнет ли она от воздействия хозяина. С бактериальной стороны PinT снижает экспрессию определенных эффекторов вирулентности SPI-1 и SPI-2, которые позволяют бактериям размножаться внутриклеточно.

Слева - криоэлектронное изображение S. Typhi, взаимодействующей с мембраной клетки хозяина. Справа - сегментация изображения слева с аннотацией различных клеточных компонентов.

   В настоящее время исследователи создают одноклеточную версию двойного секвенирования РНК (scDual-seq) для изучения взаимодействия хозяина и сальмонеллы. На конференции ASM Microbe 2022 Авраам представил разработанную в его лаборатории методику под названием scPAIR-seq для анализа патоген-специфических иммунных реакций в контексте инфекции S. Typhi. Этот метод позволяет исследователям изучать воздействие нескольких бактериальных мутантов на клетки хозяина одновременно и с разрешением в одну клетку.

   В данной работе исследователи инфицировали макрофаги библиотекой уникальных штрих-кодов бактерий, имеющих мутации в эффекторах вирулентности SPI-2, чтобы изучить специфические для мутантов изменения транскриптома хозяина. Они обнаружили, что среди эффекторов вирулентности SifA оказывает наиболее значительное влияние на транскриптомы хозяина. SifA помогает сальмонеллам создать защитную нишу внутри вакуолей в макрофагах. В отсутствие SifA S. Typhi присутствует в цитоплазме вместо вакуолей и перепрограммирует инфицированные макрофаги в противовоспалительное состояние М2. Это позволяет бактериям размножаться в цитозоле, что позволяет предположить альтернативный путь заражения. Экспериментальная и компьютерная схема, разработанная в данном исследовании, может быть использована для изучения влияния нескольких эффекторов одновременно у других патогенных бактерий, а также для обеспечения глобального и целостного представления о влиянии эффекторов на иммунные процессы хозяина.

   RNA-seq, и в частности scRNA-seq, становится все более популярным выбором для анализа изменений в экспрессии генов во время взаимодействия хозяина и патогена. Эти методы позволили по-новому взглянуть на инфекции S. Typhi и получить представление о гетерогенности как клеток хозяина, так и бактерий. Такие исследования могут раскрыть молекулярные детали того, как иммунные клетки уничтожают патогены, и пространственно-временную эффективность различных противомикробных терапий.

   В настоящее время ведется работа по созданию клеточных атласов в различных модельных организмах для выявления различных типов и состояний клеток. Проект "Иммунологический геном" - один из таких проектов, в рамках которого создаются профили экспрессии генов для всех типов иммунных клеток мыши, и он должен сыграть ключевую роль в понимании взаимодействия хозяина и патогена. Этот атлас может быть использован для понимания того, какие гены модулируются в различных типах иммунных клеток во время бактериальных инфекций. Используя такие ресурсы, можно начать отвечать на вопросы почему бактерии инфицируют или размножаются в одних клетках, а не в других, какие иммунные клетки хозяина более восприимчивы к инфекции и почему.

   Ученые также предпринимают попытки перенести результаты РНК-секвенирования из лаборатории в клинику. В одной из таких попыток исследователи применили алгоритм, основанный на данных scRNA-seq, для прогнозирования исхода инфекции Salmonella у здоровых людей ex vivo по образцам их крови. Люди с различными типами иммунных клеток - либо с диким типом, либо с полиморфизмом в гене TLR10, который регулирует цитокиновый ответ, - демонстрируют различные фенотипы инфекции. Будущая работа по формированию когорт и прогнозированию клинических исходов инфекционных заболеваний путем анализа гетерогенности на клеточном уровне может помочь в разработке персонализированной терапии для отдельных пациентов.

Источник:

ASM, 11 Aug 2022

Вам также может быть интересно
Комментариев: 1
Nataliabluet
2023-04-18 18:33:28 +0300
Соглашусь с автором, действительно я сама столкнулась с рядом заболеваний, бесмысленная трата денег на обследование, обратилась к доктору жукову, он внимательно изучил всё, сделала полное обследование сразу, и видно было через неделю как общее состояние улучшилось, поэтому здесь больше всего зависит от человека кто вас обследует, очень много врачей которые не хотят вникать в ваши болячки
Ответить
Узнайте о новостях и событиях микробиологии
Первыми получайте новости и информацию о событиях
up