Хотя царство грибков насчитывает невероятное количество разнообразных видов, лишь некоторые из них способны заражать человека и вызывать либо поверхностные инфекции, либо инвазивные заболевания, которые могут распространяться на жизненно важные внутренние органы, приводя к сепсису и смерти.
К счастью для человека, от большинства видов грибков мы защищены нашими слизистыми барьерами, иммунной системой и физиологической температурой тела, которые не позволяют потенциальным патогенам вызывать системные заболевания. Однако применение иммуносупрессивных схем в современной медицинской практике и подавление иммунитета вследствие инфицирования ВИЧ-1 привели к резкому увеличению числа уязвимых людей за последние годы, и, как следствие, грибковые патогены стали одной из ведущих причин смертности людей, ежегодно приводя к ~2,5 миллионам смертей.
Одним из ведущих факторов смертности людей является Candida albicans, условно-патогенный грибок, который существует как комменсальный член микробиоты человека до тех пор, пока такое событие, как иммуносупрессия хозяина, не даст ему возможность инфицировать. Основываясь на таких критериях, как уровень заболеваемости, смертности и устойчивости к противогрибковым препаратам, Всемирная организация здравоохранения недавно отнесла C. albicans к патогенам, представляющим критическую угрозу.
Успех C. albicans как комменсала и как патогена зависит от его способности чувствовать и адекватно реагировать на изменения в окружающей среде. Одним из наиболее заметных признаков вирулентности C. albicans, который нуждается в остром восприятии окружающей среды, является морфогенез, то есть способность переключаться между одноклеточными и многоклеточными нитевидными формами роста. Большинство мутантов, которые фиксируются в любом из этих состояний, являются авирулентными в мышиных моделях системного кандидоза. Многие исследования in vitro были посвящены изучению сигнальных путей, которые позволяют C. albicans чувствовать и реагировать на различные стимулы, вызывающие образование филаментов, включая повышенное содержание углекислого газа, голодание на фоне недостатка питательных веществ и интернализацию макрофагами.
Большинство индуцирующих сигналов поступает через циклический АМФ (цАМФ), протеинкиназу А (ПКА), при этом повышение уровня внутриклеточного цАМФ вызывает активацию комплекса ПКА, который фосфорилирует транскрипционные факторы, такие как Efg1, для повышения экспрессии специфических для гиф генов. Однако для того, чтобы эти сигнальные каскады вызвали интенсивный филаментный рост, необходимо одновременное повышение температуры по крайней мере до 37°C. Устойчивая филаментация также индуцируется при культивировании C. albicans при температуре 39°C и выше, и, таким образом, высокая температура представляет собой независимый индуцирующий фактор. Учитывая, что температура тела пациента может превышать эти пороговые значения во время лихорадочных эпизодов, нам крайне важно понять, как температура влияет на этот ключевой признак вирулентности.
Термотолерантность и температурно-зависимая филаментация неразрывно связаны через молекулярный шаперон Hsp90. В предыдущих работах было установлено, что Hsp90 является репрессором морфогенеза, поэтому при высоких температурах, когда функциональные возможности шаперона превышаются из-за накопления неправильно сформованных белков, его репрессия на ПKA-сигнализацию ослабевает, обеспечивая тем самым филаментный рост. Об этом также свидетельствует тот факт, что фармакологическое ингибирование Hsp90 или генетическое истощение HSP90 приводит к индукции филаментации независимо от повышенной температуры. Кроме того, функция Hsp90 в гомеостазе белков необходима для термотолерантности. Таким образом, Hsp90 связывает морфогенез и термотолерантность, но другие генетические пути еще предстоит изучить.
Функциональные и химико-геномные исследования помогли обнаружить клеточные процессы, которые позволяют C. albicans переключаться между различными морфологическими состояниями. Например, эндоцитоз критически важен для филаментации, поскольку он необходим для рециркуляции мембран и мембранных белков на растущем кончике гифы. Поэтому соединения, препятствующие эндоцитарному трафику, или генетическая делеция эндоцитарных компонентов, таких как RVS161, RVS167 и ENT2, приводят к блокированию филаментации.
Кроме того, функциональный геномный скрининг библиотеки репрессируемых мутантов C. albicans выявил ключевую роль биосинтеза эргостерина в регуляции филаментации, что подтверждается тем фактом, что сублетальные концентрации противогрибкового препарата флуконазола, который направлен на биосинтез эргостерина, также блокируют филаментацию. Наконец, генетический анализ показал, что правильная организация актина является критической для филаментации, как для доставки секреторных везикул по актиновым волокнам, так и для формирования актиновых зон, необходимых для эндоцитоза. В частности, обработка актин-деполимеризующими препаратами цитохалазином А или латрункулином А ингибирует морфогенез и подавляет экспрессию гифально-специфического гена HWP1. В целом, эти подходы позволили выявить разнообразные клеточные процессы, регулирующие морфогенез, но наше понимание биологической сложности, лежащей в их основе, все еще остается неполным.
Сплайсосома - это большой динамичный РНК-белковый комплекс, который координирует удаление интронов для получения сплайсированной мРНК в результате двухступенчатой реакции трансэстерификации. У Saccharomyces cerevisiae в сплайсинге мРНК участвуют более 100 белков, включая те, которые образуют комплексы с пятью малыми ядерными РНК (snRNAs) для создания малых ядерных рибонуклеопротеидов (snRNPs) и вспомогательных белков, не относящихся к snRNP, которые помогают катализировать процесс.
Высокодинамичная конформация сплайсосомы не только обеспечивает точный сплайсинг различных субстратов, но и открывает возможности для регуляции в ответ на изменения окружающей среды. У грибков наиболее распространенной формой альтернативного сплайсинга является удерживание интрона (IR), при котором интрон избирательно сохраняется в конечном мРНК-продукте. Хотя только ~5 % генов S. cerevisiae имеют интроны, регуляция их сплайсинга может влиять на способность организмов адаптироваться к изменениям окружающей среды. Например, у модельных дрожжей разные наборы транскриптов подвергаются снижению сплайсинга при воздействии двух не связанных между собой экологических стрессов - аминокислотного голодания и этаноловой токсичности.
Кроме того, интрон-опосредованная регуляция гена рибосомального белка RPS22B вызывает фенотипическую гетерогенность у S. cerevisiae в ответ на голодание, что позволяет клеткам адаптироваться к изменяющейся среде. В целом это позволяет предположить, что интроны были выборочно сохранены в геноме S. cerevisiae как механизм, способствующий выживанию клеток в изменчивой среде.
Сплайсосомы хорошо сохранились среди эукариот, особенно среди S. cerevisiae и C. albicans. Также у S. cerevisiae и C. albicans сохраняется архитектура интрон-содержащих генов, в основном с одиночными интронами, которые находятся в пределах 5′ части транскрипта. Несмотря на то, что только ~6 % генов C. albicans имеют интроны, в этом организме были изучены примеры альтернативного сплайсинга. Кроме того, обогащение специфических биологических процессов, таких как сборка рибосом, трансляция, синтез АТФ под действием протонной движущей силы и связывание РНК, интронсодержащими генами позволяет предположить, что интроны играют важную роль в C. albicans, что требует дальнейшего изучения.
В данной работе мы провели функциональный геномный скрининг для выявления положительных регуляторов филаментации C. albicans, индуцированной ростом при высоких температурах. В результате этого анализа мы выявили 38 генов, генетическое истощение которых приводило к дефекту филаментации без существенного влияния на рост, многие из которых важны для сплайсинга мРНК. Таким образом, мы создали серию мутантов, охватывающую все гомологи C. albicans компонентов сплайсосомы S. cerevisiae, и дали подробную характеристику их роли в филаментации.
Кроме того, мы провели РНК-секвенирование для картирования изменений сплайсинга и экспрессии в дрожжах дикого типа и филаментах, а также в мутанте сплайсосомы, который не способен к филаментации, и обнаружили IR как сложный модулятор тонкой настройки экспрессии генов, регулирующий морфогенез. В целом, эта работа пополняет растущий объем знаний о роли интронов у грибков и позволяет по-новому взглянуть на клеточные процессы, регулирующие ключевой признак вирулентности у C. albicans.
