Загадочные "хранилища" можно модифицировать для мониторинга РНК, что будет способствовать изучению рака и не только.
Бочкообразные структуры, которые тысячами встречаются в клетках большинства животных, являются одной из самых больших загадок биологии. И хотя исследователи еще не выяснили функцию этих “хранилищ”, теперь они сообщают об их новом применении. Группа исследователей использовала хранилища для сбора РНК и записи почти всей генной активности в группах клеток на срок до 7 дней, что позволяет получить беспрецедентный взгляд на их прошлое.
Новый метод, описанный на днях в журнале Science, является “сверхмощным” и “очень инновационным”, - считает химик Цзяхуэй Ву из Массачусетского университета (США). Он и другие ученые предсказывают, что это может помочь в изучении клеточных процессов, которые развиваются во времени, например, почему некоторые опухолевые клетки становятся устойчивыми к противораковым препаратам. “Это очень здорово”, - добавляет генетик из Вашингтонского университета Джей Шендур. “Вы создаете хранилища, о которых мы едва знаем [для отслеживания РНК]. Мне нравится использовать что-то эндогенное и таинственное”.
Существующие способы регистрации генной активности клеток имеют ограничения — например, отслеживание только одного или нескольких генов или захват только тех генов, которые оказываются активными в момент вскрытия клеток. Фэй Чен, биомедицинский инженер из Института Брода (США), недавно поручил аспиранту в своей лаборатории разработать более простой и полный метод отслеживания активности генов в течение нескольких дней. Идея состояла в том, чтобы захватить месенджерные РНК (мРНК), инструкции по построению белка, создаваемые работающими генами, и сохранить их, чтобы их можно было прочитать позже.
Незащищенные мРНК обычно разрушаются в течение нескольких минут или часов. Чтобы регистрировать активность генов в течение более длительного периода, группа Чена попыталась соединить Poly A-связывающий белок (PABP), который клетки естественным образом прикрепляют к одному концу мРНК, с более стабильными молекулами, которые могли бы защитить нити. Сначала они попытались связать PABP с бактериальными белками, но система работала плохо. Затем Ю-Кай Чао, возглавлявший проект, предложил использовать "хранилища", прочитав биографию Леонарда Роума, биолога из Калифорнийского университета, который стал одним из их первооткрывателей в 1986 году и с тех пор пытается раскрыть их секреты. Чен был заинтригован. В отличие от многих биологов, он действительно слышал об этих странных объектах и предполагал, что их свойства могут быть именно тем, что нужно лаборатории.
"Хранилища" содержат 78 копий длинной молекулы, известной как основной белок хранилища (MVP), которые образуют прочную оболочку, которая в основном пуста внутри, за исключением РНК неизвестной функции и некоторых других белков, которые связываются с внутренней частью. Чтобы заставить мРНК находится внутри хранилища, ученые соединили ген PABP с ДНК, кодирующей MVP-связывающую субъединицу одного из этих внутренних белков. Когда измененный ген PABP был добавлен в клетки вместе с дополнительными копиями гена MVP, захваченные МРНК оказались во вновь созданных хранилищах (см. рисунок ниже). Чтобы определить активность генов, ученые химически вскрыли хранилища и секвенировали мРНК, чтобы идентифицировать их происхождение. “Хранилища работали действительно хорошо”, - говорит Чен, который сравнивает систему с капсулой времени и называет ее TimeVault.
Как сообщает группа Чена, этот метод зарекомендовал себя, подтвердив хорошо известные генетические реакции клеток на тепло и недостаток кислорода. Исследователи также использовали временные сдвиги для выявления генов, которые позволяют некоторым клеткам рака легких противостоять препаратам. Добавляя хранилища, записывающие мРНК, к раковым клеткам и затем подвергая клетки воздействию препарата, ученые точно определили защитные гены, которые были активны до начала лечения - предыдущие методы выявляли только те гены, которые включались в ответ. Добавление второго препарата, нацеленного на один недавно идентифицированный ген, уничтожило большинство клеток, устойчивых к первой терапии.
Роум приятно удивлен новой работой. Он говорит, что его группе не удалось поместить мРНК или гены в хранилища с помощью других молекулярных креплений. “Мы пытались годами”, - с сожалением говорит он. Разница, как он подозревает, в том, что он хотел заполнить как можно больше хранилищ для доставки потенциальных вакцин или методов лечения. По словам Роума, метод Чена позволяет хранить мРНК только в небольшом проценте хранилищ, но этого, по-видимому, достаточно, чтобы зафиксировать почти всю активность генов, особенно при одновременном изучении тысяч клеток.
В настоящее время лаборатория Чена планирует выяснить, могут ли изменения во времени регистрировать все гены, активные в одной клетке. Они также хотят внедрить гены для этой системы в организм мышей в надежде, что это поможет записать "симфонию генов", включающихся и выключающихся в организме живого животного. Эта стратегия предлагает новый вид “молекулярного селфи”, - считает Майкл Эловиц, биоинженер из Калифорнийского технологического института, чья группа разработала другие методы отслеживания активности генов. “Временные фиксации событий обеспечивают значительный прогресс в многолетнем стремлении понять клетки как динамичные объекты, постоянно меняющиеся и развивающиеся во времени”.
