Быстрое и надежное обнаружение и идентификация бактерий имеют решающее значение для клинической диагностики, персонализированной медицины и профилактики резистентности к лечению.
Традиционные микробиологические методы, основанные на культивировании и на морфологических и/или биохимических тестах, трудоемки, требуют много времени и для некоторых патогенных микроорганизмов занимают до 5-7 дней. Кроме того, эти методы ограничены доступностью коммерческих питательных сред для выявления неизвестных и трудно культивируемых видов бактерий.
В последние годы лазерная десорбционно-ионизационно-масс-спектрометрия (MALDI-MS) на основе уникальных белковых профилей быстро внедряется в клиническую практику для идентификации бактерий. Однако, несмотря на то, что сам процесс идентификации происходит быстрее, анализ на основе MALDI-MS требует такого же длительного этапа выделения, как и традиционные подходы. Время, однако, является решающим фактором в успешном лечении заболеваний, в особенности, таких как сепсис. Следовательно, идеальным сценарием микробиологической диагностики является выявление бактерий непосредственно в клиническом образце. Используя MALDI, до сих пор удавалось реализовать лишь небольшое количество применений из-за высокого содержания белка в большинстве клинических образцов. Эти анализы обычно требуют сочетания стадий экстракции и центрифугирования, использования наночастиц или микрофлюидных методов для выделения и обогащения бактерий из сложных образцов биожидкостей (например, крови, слюны и спинномозговой жидкости).
Метаболомика - это комплексное изучение малых молекул (метаболитов) в клетках, биожидкостях или тканях. Эти метаболиты являются конечными продуктами клеточных процессов и дают представление о физиологическом состоянии организма в данный момент времени. Анализируя метаболомные паттерны, мы можем идентифицировать специфические биомаркеры, которые различают биологические состояния, что делает метаболомику мощным инструментом для идентификации различных патологических состояний и понимания взаимодействия хозяина и патогена.
Бактериальные липиды и низкомолекулярные метаболиты также представляют собой альтернативный способ прямой идентификации бактерий. Этот подход был наиболее широко использован в системе микробиологической идентификации MIDI с использованием пиролизно-газовой хроматографии-МС для определения жирных кислот бактерий. В то время как биотипирование с использованием MALDI-MS в последние годы доминировало в области клинической диагностики, исследования микроорганизмов на основе метаболитов продолжались с использованием различных методов MS. Эти закономерности часто оказывались столь же специфичными для характеристики чистых культур и фенотипирования даже близкородственных видов бактерий. Известные примеры включают масс-спектрометрию с быстрой испарительной ионизацией (REIMS), nano-DESI и MasSpec Pen.
В предыдущих исследованиях регулярно высказывались предположения о том, что для обнаружения бактерий in situ в клинических образцах можно использовать видоспецифичные биомаркеры. Bregy et al. предложили концепцию летучих бактериальных биомаркеров для выявления патогенов пародонта. Используя метод вторичной ионизации электрораспылением-MS, авторы впервые провели нецелевой анализ in vitro культур пародонтальных патогенов Aggregatibacter actinomycetemcomitans, Porphyromonas gingivalis, Tanerella forsythia и Treponema denticola. Они выявили 120 специфичных для бактерий соединений и впоследствии использовали их для выявления бактерий в слюне пациента с пародонтитом (n = 1) и контрольной группы (n = 2). Было обнаружено, что в образце с пародонтитом повышенное содержание 18 соединений всех четырех видов.
В 2022 году Povilaitis et al. использовали Massspec Pen для выявления возбудителя в ряде клинических образцов, положительных на метициллинрезистентный золотистый стафилококк (MRSA), включая синовиальную жидкость и мазки тканей. Классификаторы Lasso были построены на уровне принадлежности по Граму, на уровне разграничения Staphylococcus vs. Streptococcus и S. aureus vs S. epidermis, что включало определение глицерофосфолипидов и молекул кворум сенсинга, в качестве прогностических признаков. В то время как все чистые культуры, выделенные из этих образцов, были идентифицированы правильно, в клинических образцах надежно работала только классификация по Граму.
Другие многообещающие области применения включают использование автоматизированного подхода DESI с ротационной стадией для оценки микробиома слизистой оболочки непосредственно в образцах вагинальных мазков или использование метода REIMS для оценки микробных сообществ в респираторных и не респираторных образцах при муковисцидозе, таких как кровь, моча, дренажная жидкость, вагинальные и кожные мазки.
Однако существуют четыре проблемы, связанные с непосредственным обнаружением бактерий в клинических образцах, которые еще предстоит систематически оценивать:
(i) диапазон возможных патогенных агентов намного больше (известно около 1400 видов патогенных микроорганизмов), чем в существующих базах данных (от 6 до 25 видов бактерий);
( ii) бактериальные маркеры, извлеченные из таких небольших баз данных, могут быть не такими специфичными или консервативными, как предполагалось изначально;
(iii) количество бактериальных клеток сильно варьируется при различных сценариях инфекции;
(iv) большинство возможных типов клинических образцов (например, слюна), как правило, нестерильны, что приводит к тому, что наряду с патогеном можно ожидать наличие целого ряда комменсальных организмов.
В этой работе мы уделили особое внимание пунктам (i) и (ii), чтобы оценить осуществимость стратегии, основанной на биомаркерах, которая включает в себя консервативные маркеры на основе малых метаболитов, способные идентифицировать конкретные таксоны бактерий (от типа до вида), которые мы называем таксоноспецифическими маркерами (TSM). Было обнаружено и впоследствии использовано 359 TSM для идентификации чистых бактериальных культур. Далее мы рассматривали пункты (iii) и (iv), оценив, можно ли использовать эти маркеры для обнаружения бактерий in situ в сложных матрицах.
В данном исследовании мы описываем стратегию, основанную на биомаркерах, которая использует низкомолекулярные метаболиты и липиды бактерий для прямого обнаружения бактерий в сложных образцах с помощью масс-спектрометрии. В спектрально-метаболической библиотеке 233 видов бактерий были отобраны маркеры, демонстрирующие специфичность на разных филогенетических уровнях. Используя метод одномерного статистического анализа, мы определили 359 TSM, и применили их для выявления бактерий in situ в здоровых и раковых тканей желудочно-кишечного тракта, а также образцов кала. Чтобы продемонстрировать независимость нашего метода от других методов, образцы анализировались с использованием пространственной метаболомики и традиционных методов объемной метаболомики. В данной работе TSM были обнаружены в более чем 90% образцов, что свидетельствует об общей применимости этого рабочего процесса для выявления присутствия бактерий с помощью стандартных аналитических методов, основанных на MS.
Таким образом, применение TSM может быть полезным инструментом для быстрого обнаружения бактерий в биожидкостях при скрининге первого уровня. Возможность визуализировать бактерии в зависимости от их метаболических ниш, например, при раке или инфекции, может способствовать нашему пониманию взаимодействия хозяина и микробов. Однако необходимы будущие исследования для тщательной проверки этих маркеров в различных биологических и клинических сценариях. Отличительной особенностью метаболома является то, что на него могут влиять внешние факторы окружающей среды, таким образом, на данном этапе нельзя исключить погрешности, но они потенциально могут быть сведены к минимуму за счет дальнейших измерений TSM и отработки рабочих процессов. На практике влияние как матриксов, так и других бактерий потенциально уравновешивается меньшим количеством видов бактерий, ожидаемым в определенных клинических или биологических условиях, определяемых условиями, в которых различные бактерии могут выживать и расти. Выявление и учет только соответствующих друг другу видов и матриц может еще больше увеличить количество и специфичность TSM.
