Светящийся белок поможет оценивать количество кальция в дрожжевых клетках
#генная инженерия
Ученые из ФИЦ Биотехнологии РАН определили, что с помощью белка GEM-GECO можно оценивать концентрацию кальция в клетках дрожжей.
Этот белок был ранее искусственно создан для наблюдения за концентрацией кальция в нейронах. Он является флуоресцентным, то есть при облучении светом определенной длины волны может светиться более длинноволновым свечением. В данном случае, если белок связан с кальцием он излучает синий свет, а в свободном состоянии – зеленый. При использовании этого белка для наблюдения за концентрацией кальция в клетках дрожжей было обнаружено, что он не является нейтральным для клеток, поскольку усиливает физиологические эффекты повышения концентрации кальция в цитозоле. Однако это не является препятствием для использования такого подхода для отслеживания уровня кальция в клетках в режиме реального времени при ответе клеток на внешние раздражители. Результаты исследования, опубликованы в International Journal of Molecular Sciences. Исследование проводилось при поддержке национального проекта «Наука и университеты».
В клетках растений, животных и грибов, в том числе дрожжей, ионы кальция выступают в качестве посредника, позволяющего реагировать на разные внешние раздражители. Поэтому в «спокойном состоянии» количество этих ионов в цитозоле должно поддерживаться на постоянном низком уровне. Если же он повышается, ионы перекачиваются из цитозоля в так называемое депо, которым у дрожжей служит вакуоль. В норме кальций накачивается туда с помощью специального белка-насоса PMC1, встроенного в мембрану вакуоли. У мутантов, лишенных этого транспортера, при определенных условиях ионы могут неконтролируемо накапливаться в цитозоле, что приводит к остановке деления клеток или их гибели.
Ученые из ФИЦ Биотехнологии РАН (Москва) предложили новый подход для отслеживания уровня кальция в клетках дрожжей. Для этого авторы использовали белок GEM-GECO, ген которого методами генной инженерии искусственно встроили в ДНК дрожжей. GEM-GECO имеет два важных свойства: во-первых, он светится в определенном диапазоне, благодаря чему за ним легко наблюдать, и, во-вторых, он способен связываться с ионами кальция в цитозоле — жидком содержимом клетки. При этом образуются комплексы, которые тоже испускают свечение, но с другой длиной волны. Соответственно, по характеру излучения можно оценить концентрацию цитозольного кальция.
Также авторы показали, что мутантные клетки дрожжей, у которых отсутствует транспортер PMC1, закачивающий кальций в депо, растут гораздо хуже обычных, особенно если в них синтезируется белок GEM-GECO. Это вызвано губительным действием ионов кальция, в большом количестве остающихся в цитозоле. Кроме того, оказалось, что у мутантов, лишенных транспортера PMC1, заметно увеличивается удельная продукция белка GEM-GECO.
На основе экспериментов авторы заключили, что GEM-GECO можно использовать для оценки уровня кальция в дрожжевых клетках, поскольку его переход из связанного с кальцием состояния в свободное происходит в том диапазоне концентраций кальция, который является естественным для цитозоля дрожжевых клеток при переходе из нормального состояния в режим реагирования на внешние раздражители.
