Эволюционные эксперименты на микроорганизмах позволяют изучать базовые эволюционные процессы (мутагенез, дрейф, отбор, адаптацию к новым условиям среды) в реальном времени, в контролируемых условиях и с высокой степенью детальности. В последние годы разрешающая способность таких экспериментов быстро растет благодаря развитию новых геномных и генно-инженерных технологий (см. ссылки в конце новости). В частности, большим шагом вперед стала разработка метода генетического штрихкодирования (barcoding) — добавления в геномы подопытных организмов уникальных наследуемых генетических меток. Это позволяет в ходе эксперимента на бесполых (клональных) популяциях отслеживать судьбу индивидуальных клонов — потомков клеток с разными штрихкодами. Например, если у какой-то клетки возникает полезная мутация, которая не теряется сразу из-за дрейфа, а подхватывается отбором, то это вскоре становится заметно по экспоненциальному росту частоты встречаемости данного штрихкода в популяции. О методе генетического штрихкодирования и о первых важных результатах, полученных с его помощью в эволюционном эксперименте на дрожжах, поздние — случайны («Элементы», 03.03.2015).
Метод штрихкодирования до сих пор имел одно существенное ограничение. Штрихкоды вставлялись в геномы дрожжевых клеток один раз перед началом эксперимента. После этого в ходе адаптации происходило быстрое и неотвратимое снижение разнообразия штрих-кодов. Ведь если у какой-то клетки появляется очень полезная в данных условиях мутация, то потомки этой клетки начинают усиленно размножаться, вытесняя из популяции остальные шрихкоды (см. Clonal interference). Поэтому метод до сих пор был пригоден только для анализа самых ранних этапов адаптации.
Коллективу биологов из ведущих американских университетов удалось преодолеть это ограничение, о чем они сообщили в статье, опубликованной в журнале Nature 13 ноября. Ученые усовершенствовали плазмиды, используемые для внедрения штрихкодов в геномы дрожжей, таким образом, что стала возможной последовательная вставка множества штрихкодов в один и тот же геном. В ходе эволюционного эксперимента очередное штрихкодирование проводилось каждые 100 поколений. В результате каждый клон, успевший за 100 поколений размножиться, подразделялся на множество заново помеченных «субклонов» (рис. 2). Новые штрихкоды вставляются по соседству с уже имеющимися, так что со временем в геноме формируется компактный набор штрихкодов, несущий подробную информацию о происхождении данной клетки. Чтобы ее извлечь, достаточно отсеквенировать очень небольшой фрагмент генома.
Одно из главных преимуществ многократного штрихкодирования по сравнению с однократным состоит в том, что оно позволяет отслеживать повторные полезные мутации, возникающие в клетках, которые уже несут полезные мутации, возникшие ранее. Ранее в эксперименте с однократным штрихкодированием, проведенном в 2015 году, анализ был ограничен только первыми полезными мутациями, возникшими у разных клеток и давшими начало успешным клонам. В новом исследовании основной акцент был сделан как раз на том, что было ранее недоступно, то есть на динамике появления повторных полезных мутаций.
В эксперименте участвовали две популяции исходно одинаковых (генетически идентичных) дрожжей с эффективной численностью 5×106 (в исследовании 2015 года размер популяций был примерно на два порядка больше). Одну популяцию содержали на благоприятной, богатой питательной среде YPD, другую — на кислой среде с добавлением 0,3% уксусной кислоты (YPA), что должно было обеспечить более жесткий отбор. Впрочем, авторы не вдавались в различия между этими вариантами, а наоборот, пытались уловить общие закономерности.
Каждая клетка в популяции изначально содержала один из 50 000 уникальных штрихкодов (на порядок меньше, чем в исследовании 2015 года). Эксперимент продолжался в течение 10 «эпох» длительностью по 10 суток (100 поколений) каждая. «Эпохи» были разделены девятью раундами повторного штрихкодирования, во время которых клетки получали по 50 000 новых штрихкодов. Раз в сутки, то есть каждые 10 поколений, часть популяции замораживалась для последующего секвенирования и определения частоты встречаемости штрихкодов. Таким образом, в общей сложности эволюционный эксперимент продолжался 1000 поколений.
На самом деле всё было несколько сложнее, потому что процедура штрихкодирования включает в себя этапы размножения и отбора. Здесь нужно учитывать, что, помимо штрихкода, каждая генетическая вставка содержит неработающий (лишенный старт-кодона) ген устойчивости к тому или иному антибиотику. Этот ген становится функциональным только в случае успешной интеграции в «правильную» точку генома, а антибиотик затем используется для отбора клеток, в которые вставился штрихкод. Так что на самом деле дрожжи адаптировались к переменным условиям: то к «основным», то к «условиям штрихкодирования». При этом мутации, полезные для жизни в «основных» условиях, не обязательно должны быть столь же благоприятными с точки зрения шансов благополучно перенести процедуру штрихкодирования, и наоборот. Это несколько усложняет интерпретацию результатов, но, по мнению авторов, не влияет на итоговые выводы.
По данным о численности каждого штрихкода в каждый момент времени авторы вычислили (с точностью до «эпохи») моменты появления полезных мутаций, давших начало успешным линиям, численность которых на каком-либо этапе эксперимента увеличивалась быстрее, чем это можно объяснить случайным дрейфом. На рис. 2 эти мутации показаны звездочками. На начальных этапах эксперимента в обеих подопытных популяциях появилось много таких мутаций, носители которых затем конкурировали друг с другом (в исследовании 2015 года, которое состояло только из одной «эпохи», полезных мутаций было зарегистрировано больше — в основном, по-видимому, из-за большей численности подопытных популяций).
Во многих успешных линиях впоследствии появлялись повторные полезные мутации, что приводило к появлению внутри линии разнообразных сублиний с более высокой приспособленностью, чем у исходной мутантной линии. Сублинии, в свою очередь, тоже наращивали свою численность, конкурируя друг с другом, и тоже приобретали дополнительные полезные мутации. Успешные поначалу линии, в которых не возникли дополнительные полезные мутации, в конечном счете вымерли.
Авторы также проследили, как менялась в ходе эксперимента приспособленность (скорость размножения по сравнению с предковым генотипом) отдельных линий и популяции в целом. Результаты подтвердили теоретические ожидания, согласно которым в быстро адаптирующейся клональной популяции динамика приспособленности должна быть похожа на бегущую волну (рис. 3). Постоянно возникающие полезные мутации создают новые успешные клоны и увеличивают разброс приспособленности, а отбор пытается его уменьшить, выбраковывая ту часть распределения, которая соответствует низкой приспособленности (на рис. 3, a, b, это левые края распределений, характерных для каждой эпохи). Но пока запас потенциально полезных мутаций далек от исчерпания (иными словами, пока приспособленность к данным условиям достаточно низкая, чтобы шансы случайной мутации оказаться полезной оставались высокими), прирост дисперсии приспособленности из-за новых полезных мутаций успешно противостоит уменьшению этой дисперсии из-за отбора. В результате получается «бегущая волна» — широкий разброс приспособленности вокруг неуклонно растущего среднего. Такая динамика была предсказана теоретически, но непосредственно наблюдать ее удалось впервые.
Изредка может возникнуть исключительно полезная мутация (вроде той, что произошла в популяции YPA во второй половине эксперимента в «красной» линии, см. рисунки 2, b и 3, b, d), носители которой стремительно вытесняют из популяции все конкурирующие линии. В результате резко сокращается и общее генетическое разнообразие (это особенность клональных популяций, где отбор может идти только на уровне целых геномов; при наличии полового процесса очень полезная мутация, поддерживаемая сильным отбором, «выметает» разнообразие не из всего генома, а только из непосредственных своих окрестностей, см. Selective sweep), и дисперсия приспособленности (как в эпохи 9–10 в популяции YPA). Но это, по идее, должно быть временным явлением: вновь возникающие полезные мутации должны вскоре восстановить разброс и «бегущую волну» приспособленности в быстро адаптирующейся популяции.
От чего зависят шансы той или иной линии на эволюционный успех? Если бы в каждой линии возникала только одна полезная мутация, эти шансы определялись бы просто степенью ее полезности. В действительности, как оказалось, итоговая успешность линии довольно слабо зависит от полезности первой мутации, с которой началась история линии. Важнее, приобретет ли линия дополнительные полезные мутации. Исследование выявило многочисленные резкие скачки приспособленности (leapfrogging), когда в результате очередной удачной мутации часть представителей какой-нибудь отстающей линии внезапно вырывается вперед, обгоняя конкурентов из других линий (рис. 3, c, d). Авторы отмечают, что прежние теоретические модели сильно недооценивали частоту подобных скачков.
С другой стороны, между вероятностью появления в линии новых полезных мутаций и текущей приспособленностью линии существует корреляция: в более приспособленных линиях удачных мутаций возникает больше. Тому есть две причины. Во-первых, чем выше относительная приспособленность линии, тем быстрее растет ее численность, а чем больше клеток, тем выше вероятность, что в какой-то из них произойдет полезная мутация. Во-вторых, быстрый рост численности, характерный для линий с высокой приспособленностью, снижает вероятность того, что возникшая в такой линии полезная мутация потеряется из-за дрейфа раньше, чем отбор ее подхватит . Это согласуется с результатами эксперимента, показывающими, что в более успешных линиях отбор подхватывает и слабополезные мутации, и очень полезные, тогда как в менее успешных линиях — только очень полезные. В результате действия этих факторов на переднем краю «бегущей волны» приспособленности скорость появления новых успешных сублиний может нарастать.
Найденные закономерности, возможно, характерны для многих организмов с преобладанием клонального размножения, у которых перекомбинирование генетического материала разных особей отсутствует или играет небольшую роль: прокариот, вирусов, раковых клеток. Но главное достижение, конечно, состоит в разработке замечательного метода обновляемого генетического штрихкодирования, позволяющего с небывалой детальностью отслеживать эволюционные процессы в популяциях микроорганизмов.
