Будущее синбиотиков: разработка рациональной рецептуры и дизайна (аннотация)Будущее синбиотиков: разработка рациональной рецептуры и дизайна
Несмотря на десятилетия исследований пробиотиков и пребиотиков, получение положительных клинических результатов при использовании этих продуктов остается сложной задачей.
Конечно, отчасти это объясняется широким ассортиментом видов и штаммов пробиотиков, разнообразием структур пребиотиков, различными дозами пробиотиков и пребиотиков, а также конкретными целевыми результатами, которые определяются в этих исследованиях. Но еще одним важным моментом являются экологические ограничения, которые влияют на способность пробиотических микроорганизмов или пребиотических субстратов вызывать изменения в желудочно-кишечном тракте. В конце концов, пробиотики часто превосходят по численности комменсальную микробиоту миллион к одному. Во многих пробиотических продуктах содержаться микробы не человеческого происхождения и они не имеют необходимых признаков для конкуренции и сохранения в ЖК. В частности, способность захватывать и потреблять неперевариваемые углеводы и другие специализированные ресурсы является основным фактором, определяющим, сможет ли данный микроб занять нишу, даже транзиторно в среде ЖКТ.
Эффективность одних только пребиотиков также подвержена аналогичным персонализированным ограничениям. Например, чтобы пребиотики служили селективными субстратами, в микробиоме человека должны присутствовать соответствующие микроорганизмы, способные потреблять эти субстраты и преобразовывать их в полезные для хозяина продукты. Возможно также, что субстраты, не обладающие достаточной структурной или химической специфичностью, способствуют нецелевому обогащению членов микробиома кишечника, что приводит к отсутствию полезных эффектов для хозяина. В совокупности эти экологические соображения, в дополнение к иммунологическим, физиологическим и другим факторам хозяина, способствуют формированию фенотипа отсутствия ответа (non-responder phenotype), который обычно наблюдается в различных исследованиях и популяциях. Таким образом, одним из преимуществ концепции синбиотиков является возможность обойти эти экологические ограничения путем предоставления микроорганизма вместе с субстратом, который поддерживает рост этого микроба.
Синбиотики (или, по крайней мере, продукты, маркированные как синбиотики) в последние годы привлекают значительное внимание потребителей, несмотря на то, что еще десять лет назад они не были очень распространены на рынке добавок или продуктов питания. Действительно, в недавнем исследовании, проведенном с использованием данных, полученных в ходе Национального обследования здоровья и питания (NHANES), более 1% взрослых и детей США сообщили о потреблении непищевых (например, добавок) синбиотиков, по сравнению с 5 и 2%, соответственно, для пробиотиков и пребиотиков (O'Connor et al., 2021). Пожилые люди (>60 лет), в частности, были более частыми потребителями этих продуктов: среди этой группы употребление синбиотиков составило около 2%. Авторы считают, что это относительно высокие показатели распространенности для невитаминных или неминеральных БАДов. Аналогичным образом, прогнозируется глобальный рост применения синбиотиков в продуктах питания, как молочных, так и немолочных, ферментированных и неферментированных. Общий объем продаж синбиотикосодержащих продуктов питания и добавок приближается к 1 млрд долларов США.
Составление и тестирование синергических синбиотиков является сложной задачей.В литературе мало сообщений, в которых дается какое-либо конкретное обоснование или стратегия формулирования таких синбиотиков. Без такой стратегии нельзя ожидать, что сочетание пробиотика с пребиотиком обязательно приведет к синергизму. Скорее, должна быть метаболическая, функциональная или другая научная основа для того, чтобы ожидать синергического эффекта от двух компонентов. Более того, для успешного создания синергетических синбиотиков необходимо учитывать экологические ограничения, существующие в кишечнике. Это противоречит слишком упрощенному представлению о том, что одно питательное вещество может стимулировать колонизацию микроба-компаньона. Это особенно очевидно, поскольку последние исследования подтвердили экологическую сложность и индивидуальность микробиома кишечника человека (Nayak and Turnbaugh, 2016; Ryu et al., 2021) и важную роль перекрестного питания клетчаткой в кишечнике (Boger et al., 2018; Cantu-Jungles and Hamaker, 2020).
Действительно, можно предположить, что пребиотический субстрат может быть частично разложен первоначально членами резидентной микробиоты, а оставшиеся компоненты потребляются и обогащают совместно вводимый пробиотический микроб, который затем обеспечивает пользу для здоровья хозяина. И наоборот, возможно также, что добавленный микроб преобразует субстрат в компоненты, которые затем метаболизируются микробами-комменсалами или микробами-компаньонами.
Пример последнего случая был описан в исследовании in vitro (Boger et al., 2018), где исследователи показали, что пробиотический штамм Lacticaseibacillus paracasei subsp. paracasei (ранее Lactobacillus) продуцировал внеклеточную экзоинулиназу GH32, которая разлагала фруктаны с высокой степенью полимеризации (DP). Затем образовывались более мелкие молекулы DP, которые потреблялись лактобактериями-компаньонами, не способными использовать более крупные субстраты DP. Таким образом, эти штаммы в сочетании с инулином или другими более длинноцепочечными фруктонами могут быть использованы в качестве синбиотических смесей для перекрестного кормления. Однако для того, чтобы определить, обеспечивает ли такая формула синергетическую пользу для здоровья хозяина, необходимо провести клинические испытания.
Еще один пример синергизма, основанного на косвенном эффекте, был недавно зарегистрирован для перорального синбиотика (Bijle et al., 2020). В этом исследовании in vitro хорошо изученный пробиотик Lacticaseibacillus rhamnosus GG (ранее Lactobacillus rhamnosus) был объединен с аминокислотой аргинином. Цель заключалась в разработке синбиотика, способного подавлять Streptococus mutans, возбудителя кариеса. Аргинин утилизируется комменсальными микробами через систему аргининдеиминазы (ADS), в результате чего образуется аммиак. Последний повышает рН, что является ингибирующим фактором для S. mutans. Хотя L. rhamnosus GG, как оказалось, не экспрессирует ADS, его рост был усилен аргинином, и поэтому он косвенно способствовал ингибированию S. mutans.
Синбиотики на основе полифенолов также могут быть опосредованы косвенным метаболизмом в кишечнике, как недавно предложили Sharma и Padwad (2020). Предполагается, что богатые полифенолами продукты, включая красное вино (Moreno-Indias et al., 2016), оливковое масло (Martín-Peláez et al., 2016), гранаты (Cortés-Martín et al., 2021) и ягоды (Jamar et al., 2020), обогащают бифидобактерии. Как происходит их метаболизм в кишечнике, менее ясно, но, по-видимому, через несколько этапов перекрестного питания (Parkar et al., 2013). Таким образом, полифенольный субстрат может быть преобразован непосредственно в биоактивные молекулы, которые приносят пользу здоровью хозяина, или косвенно в метаболиты, используемые другими микробами для производства полезных конечных продуктов.
Учитывая значительные затраты, связанные с проведением клинических испытаний, может быть оправдано применение доклинических подходов к разработке и тестированию потенциального синергизма. Таким образом, априорная идентификация штаммов и субстратов, которые, как ожидается, будут отвечать критериям синергизма синбиотиков, остается сложной задачей. Для достижения этой цели мы описываем несколько доклинических или in vitro платформ.
Подход, называемый обогащением in vitro (IVE), был описан Kok et al. (2019). Исследователи использовали метод in vitro, при котором ксилоолигосахариды (XOS) добавлялись в емкости для ферментации фекалий, после чего проводилось ежедневное поэтапное разведение для имитации желудочно-кишечного потока. Метод IVE имеет экологическую основу, поскольку он отбирает штаммы, которые способны противостоять давлению разбавления, быстро расти, сохраняться в среде in vitro и конкурировать с комменсальными микробами за субстрат XOS. Через ∼20 поколений были выделены и идентифицированы автохтонные штаммы, обогащенные XOS. Когда один из обогащенных штаммов, Bifidobacterium longum subsp. longum CR15, был повторно инокулирован в свежие фекальные ферменты в присутствии или отсутствии XOS, штамм CR15 сохранялся, но только в присутствии XOS. Таким образом, если предположить, что повышенная устойчивость отражает синергизм, платформа IVE может оказаться эффективным высокопроизводительным методом для выявления предполагаемых синергических комбинаций синбиотиков до проведения клинических испытаний.
Недавно был описан еще один подход in vitro, основанный на сопоставлении фенотипических и генотипических свойств предполагаемых пробиотических штаммов (Fuhren et al., 2020). Коллекция из 77 штаммов Lactiplantibacillus plantarum (ранее Lactobacillus plantarum) была проверена на способность расти на ряде пребиотиков, включая инулин, изомальтоолигосахариды (IMO), арабиноксилоолигосахариды и фукоидан, а также на способность использовать углеводы, определенную с помощью хроматографических методов. Геномы штаммов с соответствующими фенотипами утилизации субстратов были проанализированы, чтобы соотнести эти модели роста с определенными кластерами генов утилизации углеводов. Соответственно, были определены штаммы, чьи фенотипы инулина и IMO соответствовали наличию соответствующих кластеров генов. Этот высокопроизводительный скрининговый подход in vitro, как и метод IVE, обеспечивает рациональную основу для составления высокоселективных синбиотических пар перед клиническими испытаниями.
Обновленное определение синергетического синбиотика не требует, чтобы отдельные компоненты (т.е. субстрат и микроб) соответствовали определениям пробиотика или пребиотика. Такое представление было призвано обеспечить основу для инновационных, экологически обоснованных комбинаций субстратов и микробов. Соответственно, за последние несколько лет появилось несколько примеров, основанных на этом понимании. Один из таких примеров, состоящий из L. rhamnosus GG и аргинина, был описан выше. Хотя ни один из этих компонентов по определению не может считаться пероральным пробиотиком или пребиотиком, вместе они подавляли S. mutans in vitro. Если бы этот эффект можно было продемонстрировать in vivo, он бы отвечал требованиям синергетического синбиотика.
Недавно был описан еще один новый предполагаемый синбиотик (Perraudeau et al., 2020), который содержит Bifidobacterium longum subsp. infantis, а также четыре так называемых пробиотических бактерии нового поколения, включая Akkermansia muciniphila, Clostridium beijerinckii, Clostridium butyricum и Anaerobutyricum hallii. Эти штаммы были отобраны на основе их способности разлагать олигосахариды (A. muciniphila и B. infantis) и производить бутират (A. hallii, C. beijerincki и C. butyricum). При сочетании с инулином и назначении участникам с диабетом 2 типа синбиотик улучшал постпрандиальный уровень глюкозы по сравнению с плацебо. Однако это было двухкомпонентное исследование, поэтому невозможно было приписать результат синбиотику или одному из отдельных компонентов.
В дополнение к исследованиям на людях, недавно был изучен синергетический синбиотик для укрепления здоровья животных (Mohammadi et al., 2022). В этом исследовании молочнокислая бактерия, используемая в качестве кормовой добавки для животных, Pediococcus acidilactici CNCM I-4622, была объединена с растительным полисахаридом, полученным из скорлупы фисташкового ореха. По отдельности эти компоненты усиливали рост и сопротивляемость инфекционным заболеваниям выращиваемой рыбы тилапии. Однако в сочетании с синбиотиком экспрессия иммунных биомаркеров и устойчивость к Aeromonas hydrophila, возбудителю заболеваний рыб, были выше, чем у отдельных компонентов, что указывает на синергетическую активность комбинации. Кроме того, концентрация уксусной и пропионовой кислот в кишечнике была выше при использовании синбиотика. Авторы предположили, что эти короткоцепочечные жирные кислоты могут способствовать наблюдаемой антибактериальной активности, а также поддерживать рост эпителиальных клеток кишечника.
Синбиотики обладают значительным потенциалом для модуляции микробиома кишечника и улучшения здоровья человека и животных. Как с коммерческой, так и с клинической точки зрения, улучшение здоровья сверх того, что дает пробиотический микроб или пребиотический субстрат, будет выгодно потребителям. Синергетические синбиотики могут усилить развитие и/или персистенцию микроба-компаньона и могут улучшить клинические результаты по сравнению с пробиотиками или пребиотиками в отдельности. Кроме того, хорошо разработанные синергические синбиотики могут быть эффективной стратегией для преобразования не отвечающих на лечение пациентов в отвечающих, тем самым повышая эффективность лечения у большего числа потребителей.
Несмотря на эти возможности, синергетические синбиотики сложно разработать, и лишь немногие из них, если таковые вообще имеются, показали свою клиническую эффективность. Большинство клинических исследований не включали соответствующие пребиотические или пробиотические контроли, а во многих из них не проводился соответствующий анализ микробиоты. Кроме того, часто отсутствует обоснование выбора пребиотических субстратов и пробиотических микроорганизмов. Безусловно, разработка эффективных пребиотиков, пробиотиков и синбиотиков, способных принести пользу здоровью, будет зависеть от достижений в области изучения микробиоты кишечника. В частности, расширение возможностей секвенирования и компьютерных моделей позволит лучше понять сложные экологические взаимоотношения в микробиоме кишечника и улучшить разработку синбиотиков и других продуктов для здоровья кишечника.
