Метод CRISPR-Cas9 произвел революцию в биологии и здравоохранении.
Он использует иммунную защитную систему бактерий для точного редактирования генома. Но этот метод не совершенен. Он может вставлять нежелательные сиквенсы ДНК, полностью удалять сегменты и ошибочно модифицировать нецелевые гены. Исследование, опубликованное вчера (1 июля) в журнале Science Advances, сообщает, что альтернативный "мягкий CRISPR" под названием CRISPR-Nickase может эффективно и безопасно редактировать ДНК.
CRISPR-Nickase использует тот факт, что у человека есть две копии каждого гена - по одной от каждого родителя. Cas9, молекулярные ножницы, которые вырезают целевые гены, имеют два активных участка, которые разрезают каждую копию. Никаза - это мутант Cas9, у которой один сайт деактивирован, поэтому она разрезает только одну копию.
Одиночные разрезы удобны, когда дефектна только одна версия гена, что часто встречается при многих генетических заболеваниях. CRISPR-Nickase может удалить дефектную копию, а собственный механизм репарации ДНК клетки может затем скопировать нормальную версию на ее место. Это отличается от традиционного CRISPR-Cas9, где для восстановления повреждений, вызванных разрывом двойной нити, требуется экспериментально введенный шаблон ДНК - процесс, который чреват ошибками, говорит соавтор исследования Этан Бир, биолог в области развития из Калифорнийского университета.
Однако исправление повреждений - обычное дело для клеток. Каждый раз, когда ген копируется или экспрессируется, клетка перерезает ДНК, чтобы размотать ее, и восстанавливает ее для повторной конденсации. "Это происходит тысячи и тысячи раз в день", - говорит Бир, который основал две компании, работающие с использованием технологии редактирования генов CRISPR: Synbal Inc., которая занимается разведением животных для исследований, и Agragene, которая разрабатывает средства борьбы с вредителями.
Поскольку клетки естественным образом восстанавливают повреждения, исследователи предположили, что CRISPR-Nickase может стать эффективным способом редактирования отдельных копий гена. В исследованиях, опубликованных другими учеными, никаза показала свою эффективность при работе со спермой и яйцеклетками плодовых мушек, которые несут только одну копию каждого гена. Это исследование показывает, что она также может работать в соматических клетках, которые несут две копии.
Авторы проверили новую методику CRISPR, использовав ее для изменения цвета глаз у плодовых мушек. Ген, на который они нацелились, в функциональном состоянии кодирует красные глаза, но у выращенных в лаборатории мух-мутантов, которых они сконструировали, были две дефектные копии, которые вместо этого кодировали белый цвет глаз.
Эти копии отличались тем, где произошла мутация. Копия матери была функциональна в первом участке, но мутировала во втором, тогда как копия отца была функциональна во втором участке и мутировала в первом. Исследователи придумали CRISPR-Nickase для того, чтобы перерезать ДНК в мутировавшем отцовском сайте 1 и заменить его функциональной копией этого сайта из материнского гена. Восстановленная отцовская копия кодировала производство красных глазных пигментов, восстанавливая нормальный цвет глаз. Каждый глаз представлял собой мозаику из красного и белого цветов, причем красный цвет означал успешное редактирование гена.
Исследователи протестировали модифицированный подход в сравнении с традиционным CRISPR-Cas9 и обнаружили, что Nickase превосходит Cas9 в разы. У мух, отредактированных CRISPR-Cas9, в среднем 20-30% глаз каждой мухи становились красными, а у CRISPR-Nickase этот показатель составлял 50-70%. Соавтор исследования Аннабель Гишар, исследователь CRISPR из Калифорнийского университета в Сан-Диего, говорит, что была поражена, когда впервые взглянула в пронзительно красные глаза отредактированных мух. "Это был фантастический, волшебный момент", - говорит она.
"Я не могла поверить, когда [Гишар] показала мне это", - добавляет Бир. "Никто не ожидал, что это сработает так великолепно".
Помимо эффективности, CRISPR-Nickase также несет меньший мутационный риск по сравнению с CRISPR-Cas9. Cas9 вызывал непреднамеренные мутации в месте редактирования в 66% случаев. Частота мутаций у Nickase составляла всего 0,7%, то есть в сто раз меньше. Это не считая мутаций в нецелевых генах. По словам Бира, CRISPR-Cas9 промахивается мимо своей цели в 1-2% случаев. Такие внецелевые мутации особенно опасны, поскольку они могут случайно нарушить здоровые гены и вызвать такие заболевания, как рак. Никаза не вызывает ничего подобного.
"Это настолько чисто, насколько это вообще возможно", - говорит Бир. "Для применения в будущем, когда вы захотите использовать метод для генной терапии, это именно то, что вам нужно.".
Бен Юэн-Кампен, биолог, изучающий CRISPR в Гарвардской медицинской школе, говорит, что появление CRISPR-Cas9 было "подобно взрыву новых методов", способствуя новым открытиям и порождая потенциальные приложения. По его словам, эффективность, с которой работает CRISPR-Nickase, стала последней "удивительной находкой", появившейся в результате быстрой эволюции CRISPR-Cas9.
Поскольку CRISPR-Nickase работает во взрослых клетках, авторы исследования говорят, что однажды метод может оказаться полезным для лечения генетических заболеваний, особенно таких, как болезнь Хантингтона или некоторые виды рака, где одна плохая копия может привести к заболеванию. Если вторая копия функциональна, CRISPR-Nickase может заменить больную версию на здоровую.
Методика должна быть проверена на млекопитающих, прежде чем будет испытана на людях и, возможно, попадет в клинику. Бир утверждает, что почти наверняка она будет лучше работать на мухах, чем на млекопитающих, потому что хромосомы мух выравниваются таким образом, чтобы шаблонная ДНК находилась рядом с местом восстановления, а клетки млекопитающих устроены иначе. Однако если исследователи смогут оптимизировать эту методику для использования на млекопитающих, ее применение может быть далеко идущим. Молекулярный груз, использующий технологию CRISPR-Nickase, потенциально может быть доставлен в такие труднодоступные области организма, как печень и сетчатка глаза.
"Трудно сказать [каковы будут области применения], не зная, насколько эффективными будут эти системы", - говорит Бир. "Но я думаю, что мы хотим добраться до тех частей тела, которые трудно восстановить каким-либо другим способом".
