Делает ли нас наша генетика более или менее восприимчивыми к КОВИД-19? Может ли генетический анализ помочь нам понять иммунный ответ на SARS-CoV-2 и найти медикаментозные мишени для помощи в борьбе с пандемией? Исследователи CRISPR занимаются этим.
Для определения новых потенциальных терапевтических мишеней для SARS-CoV-2 команда ученых из Центра генома Нью-Йорка выполнила анализ генома с помощью CRISPR (loss-of-function CRISPR screen) для систематического выбивания (knockout) всех генов в геноме человека. Группа исследовала какие генетические модификации делают клетки легких человека более устойчивыми к инфекции SARS-CoV-2. Их результаты выявили индивидуальные гены и сети генной регуляции в геноме человека, которые необходимы для SARS-CoV-2 и которые при подавлении дают устойчивость к вирусной инфекции. В совместном исследовании был описан широкий спектр генов, которые ранее не рассматривались в качестве терапевтических мишеней для SARS-CoV-2. Исследование было опубликовано в журнале Cell 24 октября.
Для того, чтобы лучше понять сложную взаимосвязь между генетическими зависимостями хозяина и вируса, команда использовала широкий спектр аналитических и экспериментальных методов для проверки результатов. Этот интегративный подход включал в себя редактирование генома, секвенирование одиночных генов, конфокальную визуализацию, а также вычислительный анализ экспрессии генов и наборов протеомных данных. Исследователи обнаружили, что эти новые генные мишени при ингибировании с помощью малых молекул (потенциальных лекарств) значительно снижали вирусную нагрузку, а в случае некоторых препаратов - до 1000 раз. Полученные результаты дают представление о новых методах лечения, которые могут быть эффективны при лечении КОВИД-19, и раскрывают молекулярные мишени, лежащие в основе этих методов лечения.
"Видя трагическое воздействие КОВИД-19 здесь, в Нью-Йорке и по всему миру, мы почувствовали, что могли бы использовать высокопроизводительные инструменты генного редактирования CRISPR, которые мы применили к другим заболеваниям, чтобы понять, какие основные гены человека требуются вирусу SARS-CoV-2", - сказал соавтор исследования Невилл Санджана, доцент биологии Нью-Йоркского университета. Ранее Саньяна применял CRISPR-скрин для выявления генетических причин различных заболеваний, включая лекарственную устойчивость при меланоме, иммунотерапию, метастазы рака легких, врожденный иммунитет, врожденные метаболические расстройства и мышечную дистрофию.
Для данного проекта редактирование генома составляло лишь половину уравнения. "Ранее мы разработали серию моделей человеческих клеток для коронавирусной инфекции, чтобы понять иммунные реакции на вирус. Было здорово объединиться с группой Невилла, чтобы понять и всесторонне профилировать гены-хозяева с нового ракурса", - сказал соавтор статьи Бенджамин ТенОвер.
Команда обнаружила, что ряд генов, тех, потеря которых существенно снижает уровень вирусной инфекции, - сгруппированы в несколько белковых комплексов, включая вакуолярные АТФазы, Retromer, Commander, Arp2/3 и PI3K. Многие из этих белковых комплексов участвуют в трафике белков в клеточную мембрану и из нее.
"Мы были очень рады видеть несколько генов в одном семействе, это дало нам высокую степень уверенности в том, что эти семейства белков имеют решающее значение для жизненного цикла вируса, для проникновения в клетки человека и для успешной репликации вируса", - сказал Жарко Данилоски, соавтор исследования.
В то время как исследователи проводили CRISPR скрин с использованием клеток легких человека, группа также изучала, является ли экспрессия требуемых генов хозяина специфичной только для легких или экспрессируется более широко. Среди генов топ-уровня, только ACE2, рецептор, отвечающий за связывание вирусного белка шипа SARS-CoV-2, показал тканеспецифическую экспрессию, а остальные гены топ-уровня имели широкую экспрессию во многих тканях, что указывает на то, что эти механизмы могут функционировать независимо от типа клетки или ткани. Используя протеомные данные, они обнаружили, что некоторые из генов хозяина непосредственно взаимодействуют с собственными белками вируса, выявляя их центральную роль в жизненном цикле вируса. Группа также проанализировала общие гены хозяина, необходимые для других вирусных патогенов, таких как пандемический грипп H1N1 и вирус Зика.
После завершения первичного скрина исследователи использовали несколько различных методик для подтверждения роли многих генов высшего ранга в вирусной инфекции. Используя линии клеток человека, полученные из легких и других органов, восприимчивых к SARS-CoV-2, они оценивали вирусную инфекцию после выбивания генов при помощи CRISPR, подавления генов с помощью РНК-интерференции или лекарственного торможения. После подтверждения того, что эти манипуляции ослабили вирусную инфекцию они попытались понять механизмы, с помощью которых потеря этих генов блокирует коронавирусную инфекцию.
Используя недавно разработанную технологию, которая сочетает крупномасштабное редактирование CRISPR с single-cell РНК-секвенированием (ECCITE-seq), команда определила, что потеря нескольких генов приводит к повышению регуляции путей биосинтеза холестерина и увеличению уровня клеточного холестерина. Используя это понимание, они изучили действие амлодипина, препарата, который изменяет уровень холестерина.
"Мы обнаружили, что амлодипин, антагонист кальциевых каналов, повышает уровень холестерина в клетках и блокирует SARS-CoV-2". Поскольку недавние клинические исследования также показали, что пациенты, принимающие блокаторы кальциевых каналов, имеют пониженный уровень смертности от COVID-19, важным будущим направлением исследований будет дальнейшее освещение взаимосвязи между путями синтеза холестерина и SARS-CoV-2", - сказал Тристан Джордан, соавтор исследования.
Опираясь на предыдущую работу по мутациям в спайковом белке и проникновению вируса через рецептор ACE2, исследовательская группа также задала вопрос о том, не может ли потеря некоторых генов придать устойчивость к коронавирусу за счет снижения уровня ACE2. Они определили один ген RAB7A, который оказывает большое влияние на транспортировку АСЕ2 к клеточной мембране. Используя комбинацию проточной цитометрии и конфокальной микроскопии, группа показала, что потеря RAB7A предотвращает проникновение вируса путем секвестирования репторов ACE2 внутри клеток.
"Современные методы лечения инфекции SARS-CoV-2 в настоящее время направлены на борьбу с самим вирусом, но наше исследование позволяет лучше понять, как гены хозяев влияют на проникновение вируса и открывает новые возможности для терапевтических открытий и, будем надеяться, ускорит выздоровление восприимчивых популяций", - сказал Саньяна.
