CRISPR-технология для редактирования РНК
Клетки человека восстанавливают разрывы РНК, вызванные программируемой системой CRISPR, что открывает путь к новым методам лечения генетических заболеваний.
Подобно функции поиска и замены в текстовом редакторе, инженерия на основе CRISPR позволяет ученым быстро и эффективно редактировать последовательности ДНК с точностью до пары оснований. Получившие признание как великие универсальные средства редактирования генов, технологии CRISPR способствовали развитию функциональной геномики и генной терапии. Однако аналогичные инструменты для редактирования РНК остаются ограниченными.
На первый взгляд может показаться нелогичным редактировать такую временную молекулу, как РНК, когда существуют инструменты, направленные на корень проблемы - ДНК. Однако редактирование ДНК не лишено рисков, таких как внецелевые мутации, а его постоянство ограничивает возможности временного исправления ситуации, например, при вмешательстве в развитие или краткосрочном лечении рака. «Именно здесь редактирование РНК может действительно изменить ситуацию», - считает Анна Немудрая, молекулярный биолог из Университета штата Монтана.
В работе, опубликованной в журнале Science, Немудрая и ее коллеги использовали специальную систему CRISPR для разрезания РНК в клетках человека и определили механизм восстановления, который клетки используют для сшивания молекулы обратно. Используя клеточные модели, исследователи показали, что их технология удаляет мутацию, распространенную у пациентов с муковисцидозом. Полученные результаты подчеркивают терапевтический потенциал программируемого редактирования РНК, а также дают исследователям инструмент для изучения более фундаментальных вопросов биологии РНК - например, как и почему человеческие клетки восстанавливают РНК?
«Статья в целом очень креативная», - отметил Дэвид Кокс, генетик из Стэнфордского университета, не принимавший участия в исследовании. «Эта технология пополнит арсенал доступных инструментов редактирования РНК, особенно для клеток млекопитающих». «[Исследование] было вдохновлено наблюдением, которое мы сделали во время пандемии COVID-19», - рассказывает соавтор статьи Артем Немудрый. В 2020 году Немудрый и Немудрая изучали системы CRISPR, но затем переключились на изучение мутаций в вирусе SARS-CoV-2, присоединившись к глобальным усилиям по изучению того, как геном этого РНК-вируса изменялся с течением времени. Исследуя мутации в ORF7a, вирусном вспомогательном белке, который противодействует противовирусным реакциям хозяина, они обнаружили редкий штамм с делецией длиной 115 нуклеотидов в геноме РНК вируса длиной 30 000 нуклеотидов.
По мере появления лекарств и вакцин у исследователей появилось время задуматься о том, как РНК-вирусы восстанавливают делеции в своем геноме, и они начали искать инструменты, позволяющие напрямую вызывать разрезы в вирусной РНК. Эндонуклеазы, управляемые CRISPR, были очевидным выбором, но для РНК вариантов было мало и они были несовершенны. Cas13 оказалась полезной для нокдауна РНК, но она наносила побочный ущерб нецелевым РНК. Хотя инактивированный нуклеазой мутант dCas13 не приводил к расщеплению вне мишени, его возможности редактирования все равно ограничены - он не может вызывать программируемые делеции в определенном месте последовательности РНК.
«Нашей мотивацией для этой работы было раскрытие других возможностей редактирования РНК», - говорит Немудрый; он искал систему, которая могла бы заменять или удалять фрагменты нуклеиновых кислот в вирусном геноме. Исследовательская группа остановилась на комплексе CRISPR III типа, который, как и Cas13, нацелен на РНК, но делает это странным или, скорее, чётным образом: он расщепляет РНК с шагом в шесть нуклеотидов. «Система CRISPR III типа очень сложна и уникальна, - считает Немудрая.
В исследовании, опубликованном в прошлом году в журнале Science Advances, ученые использовали эту рибонуклеазу CRISPR для создания шестинуклеотидных интервалов в вирусной РНК для запрограммированных удалений или вставок в геном. После этого успеха исследователи задались вопросом, может ли эта система CRISPR III типа также редактировать человеческую РНК. Чтобы проверить это, они нацелились на два транскрипта, которые высоко экспрессируются в человеческой клеточной линии HEK293T, а затем секвенировали РНК.
«Самый волнующий момент в этой работе это когда мы получили первую последовательность», - поделился Немудрый. Исследователи просматривали выравнивание чтений секвенирования, когда заметили пробелы, которые соответствовали схеме расщепления шести нуклеотидов. «Такие удаления шести, 12 или 18 [нуклеотидов] не происходят случайно - в этот момент мы понимали, что происходит восстановление [РНК]», - говорит он.
Когда комплексы CRISPR типа III расщепляют РНК они оставляют специфический химический отпечаток на каждом из двух мест разреза. В клетках млекопитающих эндогенный сплайсинг трансферной РНК приводит к появлению таких же следов, которые РНК-лигаза RTCB сшивает обратно. Эксперименты по удалению и сверхэкспрессии RTCB помогли подтвердить, что эта "ферментативная швея" также восстанавливает повреждения, нанесенные экзогенным участником - комплексом CRISPR.
«Как человека, работающего в области РНК и РНК-инженерии, меня очень удивляет, что эти [CRISPR-направленные] разрывы РНК восстанавливаются, - комментирует Кокс. Поскольку РНК - это транзиторная молекула, считается, что клетка должна очищать поврежденные транскрипты и синтезировать новые. «Нас интересует физиологическая роль этого процесса», - говорит Немудрый. «Восстанавливают ли клетки РНК и почему они это делают?»
Чтобы изучить клиническую полезность своей технологии, исследователи протестировали ее на клеточной модели муковисцидоза, где выражена мутация в транскрипте регулятора трансмембранной проводимости муковисцидоза (CFTR). Мутация - преждевременный стоп-кодон - вызывает тревожный сигнал в клетке, когда транскрипт попадает в цитоплазму, и запускает его распад до того, как он превратится в функциональный белок. Недостаточный уровень CFTR влияет на транспорт ионов в легких и способствует развитию муковисцидоза. Исследователи запрограммировали CRISPR III типа на мутантные транскрипты CFTR. Комплекс CRISPR, снабженный специальной меткой, локализующей его экспрессию в ядре клетки, выслеживал и редактировал дефектную мРНК до того, как она уходила в цитоплазму.
Хотя авторы продемонстрировали, что их инструмент для редактирования РНК с разрывом и восстановлением вырезает мутацию CFTR, эффективность была низкой, что, по мнению исследователей, является общей проблемой, с которой сталкиваются все CRISPR-редакторы на ранних этапах разработки. Кроме того, они отметили, что текущая версия CRISPR III типа обладает собственным характером и меняет схему расщепления от цели к цели. Например, в одной мишени комплекс может сделать три разреза и вырезать 12 нуклеотидов, а в другой - вызвать четыре разреза и удалить 18 нуклеотидов. С помощью дальнейших усовершенствований системы они надеются управлять рибонуклеазой, чтобы добиться более точного и эффективного редактирования РНК.
«Красота этой работы заключается в том, что это не просто технология, но и созданный нами инструмент», - говорит Немудрая, которая надеется использовать CRISPR-направленную систему разрезания и восстановления для дальнейшего изучения механизмов репарации РНК.
