Общим подходом к изучению эволюции антимикробной резистентности (AMR) является использование адаптивной эволюции для выявления мутаций, придающих резистентность.
Скорость мутаций является ключевой детерминантой эволюции. Было показано, что вариабельность этой скорости в различных сценариях играет ключевую роль в эволюционной адаптации и эволюции резистентности в условиях стресса, вызванного селективным давлением антимикробных препаратов (АМП). Многочисленные исследования эволюции AMR были проведены на планктонных бактериях. В отличие от этого, несмотря на преобладание роста биопленок в природе, на популяциях биопленок было проведено очень мало экспериментов по эволюции.
Бактериальные биопленки состоят из бактерий, прикрепленных к поверхности и/или друг к другу и встроенных в самовоспроизводящийся матрикс, и, как было показано, присутствуют и являются частью патогенеза бактериальных инфекций в большинстве систем организма человека, а также животных. Бактерии в биопленках проявляют временную фенотипическую толерантность к антимикробным препаратам. Эта толерантность носит многофакторный характер и объясняется ограничением проникновения антибиотиков, ограничением роста при низком напряжении кислорода, экспрессией специфических для биопленки генов и наличием персистирующих клеток. Следовательно, бактерии в биопленках переносят более высокие дозы АМП, чем планктонные бактерии.
Ципрофлоксацин (СIP) относится к фторхинолонам, т.е. к группе АМП, считающихся критически важными для медицины человека, где они используются для лечения различных инфекций. Фторхинолоны вызывают бактерицидное повреждение ДНК, образуя тройной комплекс топоизомераза-хинолон-ДНК, что приводит к двуцепочечным разрывам в ДНК и блокированию репликации ДНК. Повреждение ДНК запускает SOS-ответ, который индуцирует репарацию ДНК, а также мутагенез. Развитие резистентности бактерий к CIP вызывает все большую озабоченность. Поскольку многие заболевания, для лечения которых используется CIP, могут быть связаны с биопленкой, роль биопленки в развитии резистентности к CIP представляет особый интерес. Мутации в генах гиразы и топоизомеразы обычно являются основными механизмами такой резистентности. Однако в тех немногих исследованиях, которые затрагивали этот вопрос, не наблюдалось ни одного из этих механизмов, специфичных для мишеней, или наблюдалось незначительное их количество при развитии резистентности биопленки.
В настоящем исследовании мы решили подвергать резистентную биопленку E. coli воздействию летальных концентраций CIP непрерывно в течение 2 недель, как это предусмотрено клиническим планом лечения. Гипотеза заключалась в том, что обработка биопленок концентрациями CIP, превышающими их МИК, может не только не уничтожить бактерии, но и стимулировать их к выработке высокого уровня резистентности к CIP. Мы также хотели выяснить, отличается ли эволюционная траектория развития резистентности в таких условиях от той, которая наблюдается в планктонных культурах.
По результатам данного исследования продемонстрирована быстрая эволюция резистентности к CIP у обитающих в биопленках E. coli, подвергнутых длительной обработке высокими возрастающими концентрациями CIP, где начальная концентрация соответствовала 4 × МИК штамма дикого типа. Уже через 1 неделю в биопленках преобладали резистентные к CIP E. coli. Насколько нам известно, это первый случай эволюции AMR у бактерий в биопленке, постоянно обрабатываемой высокими концентрациями AMП. Полученные нами результаты свидетельствуют о том, что длительное лечение АМП может не только не устранить хронические бактериальные инфекции, связанные с наличием биопленок, но и привести к развитию AMR высокого уровня.
Примечательно, что траектория эволюции AMR в биопленках была сходной в обоих наших экспериментах, несмотря на то, что в каждом из них изучалось по шесть отдельно развивающихся биопленок. Большее число мутаций, подтверждающих резистентность к CIP, коррелировало с более высокими значениями МИК CIP. На селективных средах колонии сначала появлялись на средах с низкой и средней концентрацией CIP, затем количество КОЕ увеличивалось на средах с высокой концентрацией.
Все эти наблюдения соответствуют описанной в литературе модели пошаговой эволюции. Первичной мишенью фторхинолонов у E. coli является ДНК-гираза, но если мутирует gyrA, то мишенью становится топоизомераза IV. Соответственно, считается, что первичным событием эволюции резистентности в планктонных культурах является одиночная мутация в gyrA, за которой следуют мутации в parC и опероне mar, где каждая новая мутация повышает уровень резистентности. Именно это наблюдалось и у бактерий, обитающих в биопленке, в нашем исследовании. Наблюдаемые позиции, замененные в GyrA (Ser-83 или Asp-87) и ParC (Ser-80), по имеющимся данным, наиболее часто встречаются у резистентных к CIP E. coli. Позиция, мутировавшая в GyrB, взаимодействует с молекулой хинолона при ее связывании с QRDR GyrA. Мутации в той же позиции в ParE, что и в нашем эксперименте, также были связаны с увеличением значений МИК.
Интересно, что наши результаты отличались от ранее проведенных исследований эволюции резистентности к CIP в биопленке с Pseudomonas aeruginosa и Acinetobacter baumannii. В этих исследованиях клетки биопленки приобретали мутации только в регуляторах эффлюксных насосов, но не в генах-мишенях топоизомераз. Соответственно, их значения МИК CIP были ниже, чем у планктонных эволюционировавших клеток. Аналогичным образом, в эксперименте по эволюции резистентности к CIP в биопленках Salmonella enterica серовара Typhimurium наблюдалось широкое разнообразие мутаций, приводящих к потере порина, изменению эффлюкса и в некоторых случаях к изменению сайта-мишени, что указывает на множественность путей эволюции и резистентности.
Однако экспериментальный дизайн во всех этих работах отличался от нашего исследования по двум основным параметрам. Во-первых, их биопленки подвергались воздействию субингибирующих концентраций CIP либо в течение всего эксперимента, либо вначале с последующим увеличением концентрации. Во-вторых, продолжительность жизни биопленок, подвергавшихся воздействию, была короткой - от 1 до 3 дней. В одном из исследований общее время экспозиции составило 3 дня, в то время как в других исследовались кратковременные биопленки, многократно размножавшиеся от предыдущих биопленок. Наши результаты показывают, что бактерии, живущие в биопленке, могут выстраивать эволюционную траекторию на основе мишени, и достигать высоких МИК ципрофлоксацина, если подвергаются воздействию высоких концентраций ципрофлоксацина и им предоставляется достаточное время.
Таким образом, в данном исследовании показана эволюция высокого уровня резистентности к CIP у обитающих в биопленке E. coli, подвергавшихся воздействию летальных концентраций CIP в течение 2 недель. Это первое исследование, в котором показана эволюция AMR у бактерий, постоянно подвергающихся воздействию высоких концентраций AM и находящихся в биопленке. Резистентность, развившаяся в нашем исследовании, была целевой, т.е. обусловлена мутациями в генах топоизомераз. В отличие от предыдущих исследований, в которых использовались кратковременные биопленки, подвергавшиеся воздействию субингибирующих концентраций CIP, резистентность была низкой и нецелевой.
Кроме того, мы обнаружили, что резистентность быстрее развивалась в биопленке, чем в планктонной суспензии. Скорее всего, это объясняется тем, что защита, обеспечиваемая биопленкой, позволяла восприимчивым бактериям выживать при воздействии концентраций CIP, превышающих их МИК. Биопленки существуют и являются частью патогенеза ряда бактериальных инфекций, которые часто лечатся с помощью АМП. Поэтому данное исследование проводилось при температуре тела. Полученные нами результаты свидетельствуют о том, что лечение АМП инфекций, ассоциированных с биопленками, может быть сопряжено с высоким риском стимулирования развития АМР, а не уничтожения возбудителей.
