Фаг может убивать спящие, резистентные к антибиотикам клетки Pseudomonas aeruginosa путем прямой литической репликации (аннотация)Фаг может убивать спящие, резистентные к антибиотикам клетки Pseudomonas aeruginosa путем прямой литической репликации
В отличие от быстро делящихся клеток, которые приходят на ум при мысли о микробах, большинство бактерий на нашей планете находятся в медленном или нерастущем, спящем состоянии, характеризующемся низкоэнергетической физиологией и высокой устойчивостью к внешним воздействиям.
К ним относятся полностью неактивные споры, которые описываются как "чистейшая форма микробного покоя", а также широкий спектр покоящихся, но бдительных состояний низкой активности, готовых к реанимации при поступлении питательных веществ или сигнальных молекул. Такие спящие бактерии обычно рассматриваются как стратегия микробного страхования, обеспечивающая выживание популяции за счет сохранения гетерогенных, высокоустойчивых клеток в условиях непредсказуемых кризисных ситуаций. Во многих случаях спячка бактерий вызывается упорядоченной физиологической программой в ответ на стресс или голодание, которая также контролирует "стационарную фазу" лабораторных культур после исчерпания потенциала роста в условиях их культивирования. Для модельных организмов Escherichia coli и Pseudomonas aeruginosa эти процессы в значительной степени регулируются сигнализацией через сигма-фактор стресса и голодания RpoS, а также второй мессенджер (p)ppGpp1.
Антибиотические препараты, применяемые в клиниках, представляют собой еще одну непредсказуемую угрозу существованию, от которой бактерии могут уклоняться, находясь в состоянии покоя. В то время как антибиотикорезистентность означает способность бактерий расти в присутствии антибиотика, резистентность спящих клеток к антибиотикам приводит к более медленному их уничтожению по сравнению с растущими клетками, поскольку клеточные процессы, обычно вызываемые бактерицидными антимикробными препаратами, отключены или неактивны. Поэтому дремлющие клетки, устойчивые к антибиотикам, иногда называемые "персистирующими", могут выживать после воздействия препаратов, и их связывают с резистентностью хронических или рецидивирующих инфекций.
Несмотря на десятилетия интенсивных исследований, общие принципы, лежащие в основе функционирования этих гетерогенных персистирующих клеток, до сих пор вызывают жаркие споры, а эффективных методов лечения в клиниках пока не существует. Хотя новые антимикробные препараты, полученные в результате классических исследований in vitro, могут помочь нам в борьбе с антибиотикорезистентными инфекциями, они, скорее всего, будут столь же неэффективны против персистенции антибиотиков in vivo, как и обычные антибиотические препараты, доступные в настоящее время.
Одной из перспективных альтернативных стратегий борьбы с антибиотикорезистентностью является терапевтическое применение бактериофагов. Несмотря на долгую историю, в большинстве стран фаговая терапия остается нишевым подходом из-за технических трудностей и пресловутой недостоверности клинических испытаний. Уже почти сто лет назад в одном из специализированных исследований был сделан вывод, что "бактериофаг, который так хорошо действует in vitro, не обладает аналогичным действием in vivo".
Таким образом, физиология бактерий в месте заражения является ключевым параметром для инфекционности фага и, следовательно, для успешной фаговой терапии, но лежащие в ее основе молекулярные механизмы изучены лишь в малой степени. По аналогии с персистенцией антибиотиков, интуитивно понятно, что спячка бактерий, подвергшихся стрессу и голоданию in vivo, может препятствовать фаговой терапии. Предыдущие работы действительно показали, что продуктивность бактериофаговой инфекции положительно коррелирует со скоростью роста бактерий и что полностью остановленные в росте клетки рефрактерны к репликации фагов.
Поэтому обычно изучаемые вирулентные фаги либо избегают адсорбции на спящих бактериях, либо впадают в спячку в условиях низкоэнергетической физиологии этих клеток, пока питательные вещества не станут снова доступны и литическая репликация не возобновится. Последнее явление известно как псевдолизогения, аналогичная лизогении умеренных фагов, которые могут интегрировать свой геном в геном хозяина, например, когда они сталкиваются с голодающими бактериальными клетками.
Тем не менее, мы предположили, что фаги со способностью напрямую реплицироваться в спящих хозяевах, вероятно, существуют в природе, учитывая обилие и разнообразие спящих бактерий и плотность взаимодействия фаг-бактерия. В предыдущих работах действительно было описано несколько примеров фагов с такой способностью и сообщалось об успешных случаях фаговой терапии хронических бактериальных инфекций. Однако основные молекулярные механизмы и возможность репликации фагов на действительно глубоко дремлющих, устойчивых к антибиотикам бактериях оставались неустановленными. Изучение таких фагов позволило бы получить важные сведения о вирусной экологии в природе и открыло бы новые возможности для лечения хронических инфекций, например, путем разработки новых стратегий лечения, направленных на преодоление резистентности дремлющих бактерий.
Поэтому в данном исследовании мы провели крупномасштабные эксперименты по выделению бактериофагов, чтобы выделить новые фаги, способные непосредственно убивать резистентные к антибиотикам, спящие клетки Escherichia coli или Pseudomonas aeruginosa путем литической репликации. В то время как большинство фагов, казалось, просто впадали в спячку в этих хозяевах, мы выделили новый фаг P. aeruginosa под названием Paride, который уникальным образом реплицируется в глубоких стационарно-фазовых культурах лабораторных и клинических штаммов этой бактерии.
Интригующе, но мы обнаружили, что Paride может даже стерилизовать культуры P. aeruginosa, находящиеся в глубокой стационарной фазе, в сочетании с β-лактамом меропенемом, что приводит к синергии фага и антибиотика, которая также сильно снижает бактериальную нагрузку в модели инфекции в клетках мышиной ткани. Неожиданно оказалось, что репликация Paride в спящих бактериях в значительной степени зависела от бактериального голодания и стрессового ответа, который также необходим для антибиотикоустойчивости этих бактерий. Это позволяет предположить, что Paride специфически использует слабые места в устойчивой физиологии спящих бактерий.
Наша работа может вдохновить на создание новых методов лечения резистентных бактериальных инфекций и, в широком смысле, позволяет описать две вирусные стратегии заражения спящих бактерий (гибернация и прямая репликация), которые послужат основой для будущих исследований взаимодействия фаг-бактерия.
