Патогенные бактерии выделяют целый ряд токсичных белков, которые подрывают защитные механизмы хозяина на клеточном уровне.
Tc-токсины множества известных патогенов являются очень крупными и архитектурно сложными белками, механизм секреции которых остается весьма загадочным. Их инсектицидная функция хорошо изучена как в клеточных культурах, так и in vivo, в то время как их значение в инфекциях млекопитающих остается лишь частично изученным.
Группа под руководством Штефана Раунсера, директора Института молекулярной физиологии имени Макса Планка, обнаружила уникальный механизм секреции, который позволяет высвобождать гигантские токсины Tc. В результате атаки небольшая группа "бактерий-солдат", до отказа набитых токсинами, высвобождает свой смертоносный груз, взрываясь при этом подобно камикадзе. Использование таких субпопуляций в медицинской практике может стать перспективной стратегией лечения заболеваний, вызываемых бактериями, которые становятся все более резистентными к антибиотикам. Исследование опубликовано в журнале Nature Microbiology.
У грамотрицательных бактерий токсичные белки сталкиваются с проблемой преодоления нескольких клеточных барьеров, принадлежащих как бактериям, так и хозяину, чтобы в итоге достичь своей цели. Для этого бактерии разработали ряд специализированных систем секреции. Некоторые из них способны выделять разнообразные токсины и присутствуют почти у всех бактерий, в то время как другие были обнаружены лишь у некоторых. Механизмы секреции многих небольших токсинов уже установлены.
"Тем не менее, в течение десятилетий оставалось загадкой, как огромные Tc-токсины достигают своего конечного пункта назначения. Получив с помощью электронной криомикроскопии первые 3D-структуры Tc-токсина в наших предыдущих исследованиях, мы уже смогли выяснить, как он преодолевает последний барьер - мембрану клетки хозяина, используя механизм впрыска, похожий на шприц. Теперь мы смогли дополнить картину и показать, как эти токсины преодолевают три барьера, отделяющие внутреннюю часть бактерии от окружающей среды, действительно впечатляющим образом", - рассказал Раунсер.
В своей последней работе ученые применили передовую комбинацию нескольких методов для изучения секреции Tc-токсина YenTc, производимого патогеном насекомых Yersinia entomophaga, который имеет решающее значение для развития инфекции этим видом бактерий. Самой сложной задачей было изначально определить, какой из известных механизмов секреции используется бактериями для этой цели. Для этого ученые поочередно отключили все предполагаемые системы секреции, используя направленное редактирование генома. Когда ни один из нокаутов не остановил выделение токсина, тот же метод был использован для модификации токсина таким образом, чтобы его выделение можно было визуализировать - и на этот раз с успехом.
"Наблюдать за тем, как некоторые бактерии буквально взрываются, высвобождая свои токсины, было настоящим моментом "эврики", - делится Раунсер. Тщательный протеомный анализ позволил выявить рН-чувствительную систему секреции 10-го типа, ответственную за высвобождение токсинов, - класс механизмов экспорта белков, который был установлен совсем недавно. Последующий крио-электронно-томографический анализ позволил увидеть все детали того, как эта система секреции экспортирует клеточное содержимое с помощью ранее неизвестного литического способа действия, преодолевающего три барьера, окружающие грамотрицательные бактерии.
Ученые обнаружили, что только небольшая специализированная группа бактериальных клеток производит и экспортирует токсины, платя за это высокую цену, а именно свою жизнь. Но что заставляет эти клетки, которые авторы назвали "клетками-солдатами", сначала разрастись и произвести смертельный коктейль токсинов, содержащий YenTc, а затем совершить самоубийство во благо своих товарищей?
Сначала ученые установили, что появление клеток-солдат зависит от температуры, питательных веществ и плотности популяции клеток. Затем они обнаружили чувствительный к температуре генетический переключатель, который синхронизирует производство токсинов с производством системы секреции и превращает "нормальные" клетки в камикадзе. Массовое производство токсинов в сочетании с увеличением клеточной популяции позволяет жертвовать лишь несколькими особями ради блага бактериальной популяции, что является чрезвычайно эффективной стратегией. "Если этот механизм окажется более распространенным, мы, возможно, выявим слабое место бактерий: целенаправленное воздействие на клетки-солдаты может стать перспективной стратегией в борьбе с патогенными бактериями, особенно в условиях растущей резистентности к антибиотикам", - считает Раунсер.
Oleg Sitsel et al. Tc-токсин Yersinia entomophaga высвобождается при T10SS-зависимом лизисе специализированных клеточных субпопуляций (аннотация).
Имеются данные о том, что после секреции Tc-токсины связываются с клетками-мишенями через гликозилированные белковые рецепторы и поверхностные гликановые молекулы, после чего подвергаются эндоцитозу. Подкисление эндосомы вызывает конформационные изменения в TcA, что заставляет его центральный канал войти в эндоцитарную мембрану, в результате чего встроенный в мембрану кончик канала открывается и высвобождает цитотоксическое вещество из кокона TcB-TcC в цитоплазму клетки-мишени, где оно модифицирует субстраты, такие как Rho GTPases и актиновый цитоскелет, и в конечном итоге вызывает гибель клетки.
Подобно другим токсинам грамотрицательных бактерий, Tc-токсины должны преодолеть фосфолипидную внутреннюю мембрану, пептидогликановый кокон и липополисахаридную внешнюю мембрану, когда покидают клетку. Хотя существует несколько конкурирующих гипотез секреции Tc-токсинов, включая автотранспортировку TcB-TcC на поверхность бактерий с высвобождением под действием липазы и секрецию T3SS или опосредованную везикулами наружной мембраны.
Поиск механизма высвобождения токсина Tc осложняется тем, что в отличие от большинства грамотрицательных токсинов, они не соответствуют строгим критериям для системы секреции 1 типа (T1SS), Tat/T2SS, Sec/T2SS, Sec/T5SS, OMV, T3SS, T4SS или T6SS, опосредующих экспорт. Они также слишком велики, чтобы быть закодированными в геномах бактериофагов, подобно токсинам Шига, которые полагаются на своевременный литический вирусный выброс, опосредованный холин/эндолизин/спанин-содержащими кассетами фагового лизиса, чтобы покинуть бактериальные клетки.
В данном исследовании мы изучили механизм секреции YenTc, Tc-токсина, ответственного исключительно за чрезвычайную летальность Y. entomophaga по отношению к насекомым. Сочетая микроскопию, протеомный анализ и целевые геномные нокауты, мы обнаружили, что небольшая субпопуляция специализированных клеток, которые мы назвали "клетками-солдатами", выделяет YenTc и другие факторы вирулентности с помощью pH-чувствительного T10SS литическим способом, и определили термочувствительный регуляторный механизм, управляющий поведением клеток-солдат и координирующий производство YenTc. Затем мы визуализировали поэтапное высвобождение YenTc с помощью криоэлектронной томографии.
Эти результаты разрешают загадку секреции Tc-токсина у патогенов и показывают, как специализированные клетки придают вирулентность целым бактериальным популяциям.
