Фруктовый или ягодный сок превращается в вино благодаря процессу брожения. Причиной этого процесса становятся дрожжи, которые перерабатывают сахара в алкоголь.
Поэтому для характеристик вина важен не только сорт винограда и условия его произрастания, но и разновидности и свойства дрожжей, которые использовались на производстве. Изменяя некоторые гены дрожжей, можно улучшить качество винной продукции. Ученые ФИЦ Биотехнологии РАН разработали новый подход к редактированию генома дрожжей при помощи технологии CRISPR/Cas9 и специального маркера — гена ацетамидазы. Дрожжи для исследования были получены из коллекции микроорганизмов Всероссийского национального научно-исследовательского института виноградарства и виноделия «Магарач» РАН. Результаты работы, реализованной в рамках нацпроекта «Наука и университеты» в ходе выполнения проекта ФНТП развития генетических технологий, биологи опубликовали в журнале Biological Communications.
Дрожжи используются во множестве отраслей промышленности, включая не только выпечку хлеба, но и изготовление пива, кваса и вина, биотехнологическое производство спирта, а также получение кормового и пищевого белка. Ученые могут вносить в геном дрожжей изменения, чтобы улучшать качество продукции и повышать эффективность производства. Правда, редактирование генома дрожжей немного сложнее, чем редактирование текста на компьютере.
Технически, желаемая ДНК попадает лишь в одну из тысяч клеток дрожжей. Чтобы найти эту клетку, к нужной ДНК добавляют некоторую дополнительную ДНК, несущую позитивный селектируемый признак. Например, лабораторные штаммы дрожжей Saccharomyces cerevisiae обычно содержат несколько условно-вредных мутаций, нарушающих пути биосинтеза каких-то аминокислот. Такие мутации называют ауксотрофными генетическими маркерами. Эти штаммы не могут расти в среде, в которой отсутствуют соответствующие аминокислоты, но растут нормально в их присутствии. Чтобы доставить целевую ДНК в дрожжи, к ней добавляют ген, который нарушен у дрожжей, и далее растят дрожжи на синтетической среде, где отсутствует соответствующая аминокислота. На ней вырастают в виде колоний только те клетки, куда попала новая ДНК.
На таких ауксотрофных маркерах основано генетическое манипулирование лабораторными штаммами. Однако в промышленных дрожжах такие мутации-маркеры обычно отсутствуют. Поэтому для селекции можно использовать лишь гены, придающие дрожжам новые способности, которых лишены их предки дикого типа. Стандартный вариант — гены устойчивости к антибиотикам. Но этот подход работает ненадежно, поскольку легко ошибиться с концентрацией антибиотика, которая может зависеть и от штамма дрожжей, и от среды.
Альтернативный способ селекции может быть основан на способности дрожжевых клеток использовать необычный источник азота. Винные дрожжи не способны утилизировать ацетамид. Эта способность может быть передана одним геном ацетамидазы. Именно его в сочетании с технологией CRISPR/Cas9 ученые ФИЦ Биотехнологии РАН предложили использовать для геномного редактирования винных дрожжей. Упрощенно, система CRISPR/Cas9, как «генетические ножницы», разрезает ДНК точно в заданном месте. Этот разрыв необходимо починить, иначе клетка гибнет. «Ремонт» происходит при помощи специального фрагмента ДНК, на котором записана последовательность ДНК в месте разрыва со всеми желаемыми изменениями.
«Существенным условием при редактировании промышленных микроорганизмов является отсутствие в конечном организме какой-либо «служебной» ДНК, облегчающей лишь процесс редактирования. Этому условию наилучшим образом соответствует система CRISPR/Cas9. После того, как геном дрожжей получил нужные модификации, плазмида с CRISPR/Cas9 больше не нужна и с течением времени сама собой потеряется из модифицированных клеток», — рассказал Виталий Кушниров, доктор биологических наук, заведующий лабораторией молекулярной генетики ФИЦ Биотехнологии РАН.
Ученые создали плазмиду (небольшую кольцевую молекулу ДНК) со встроенной системой CRISPR/Cas9, дополнив ее кодирующим ацетамидазу геном. Он был взят у гриба Aspergillus nidulans. Затем исследователи протестировали эту конструкцию на промышленных и лабораторных штаммах винных дрожжей. Она была использована для редактирования генома триплоидного (то есть, имеющих тройной хромосомный набор) штамма винных дрожжей I-328 из коллекции Института виноградарства и виноделия «Магарач» РАН и гаплоидного (то есть, с одним набором хромосом) лабораторного штамма 74-D694.
«Наши результаты показывают, что плазмида с геном ацетамидазы и системой CRISPR/Cas9 может быть эффективным инструментом, позволяющим вносить изменения в геном как лабораторных, так и промышленных штаммов винных дрожжей. Ген ацетамидазы – это просто удобный селективный инструмент для дрожжей, не маркированных мутациями. Сочетание этих двух инструментов будет особенно удобно при редактировании винных или других промышленных дрожжей. Попеременное использование плазмид CRISPR/Cas9 с двумя разными селективными маркерами позволит отредактировать любое количество разных генов в одном штамме», — прокомментировал Виталий Кушниров.
