Группа исследователей разработала новый метод определения генов вирулентности Streptococcus pneumoniae.
Используя эту методику в мышиной модели пневмонии, они смогли получить новое представление о развитии этого заболевания и его взаимодействии с вирусом гриппа.
"Исторически сложилось так, что многие из смертей во время вспышек гриппа, таких как пандемия 1918 года, были вызваны пневмококковой пневмонией", - говорит Жаклин Кимми, соавтор статьи, опубликованной в Cell Host Microbe. Кимми и ее коллеги разработали новый метод функционального генного анализа для выявления генов вирулентности S. pneumoniae. Их метод основан на технологии генного редактирования CRISPR, модифицированной для избирательного отключения генов-мишеней с помощью метода, называемого CRISPR-интерференцией.
Авторы создали библиотеку CRISPRi в клетках пневмококка, включающую 1499 гидовых РНК и нацеленную на 2111 из 2146 генетических элементов прототипного штамма S. pneumoniae D39V. Эту технологию они комбинировали с секвенированием, чтобы количественно определить, какая именно гидовая РНК экспрессируется в клетках пневмококка, колонизирующих организм, следовательно, подавление каких генов менее критично для инфекции. Таким образом, метод, названный авторами CRISPRi-seq, позволяет определить вклад каждого оперона бактерии в ее относительную приспособленность.
В экспериментах CRISPRi индуцировалась доксициклином, поэтому гены не отключались до тех пор, пока бактерии (резистентные к антибиотикам) не вводились мышам с кормом, содержащим доксициклин. CRISPRi подавляет экспрессию определенных генов, почти не влияя на другие. Гидовая РНК (sgRNA) направляет на целевой участок «мертвую» Cas-нуклеазу (dCas), которая взаимодействует с ДНК, но не разрезает ее, а только препятствует транскрипции конкретного гена. Это позволило ученым легко отслеживать каждый штамм после инфицирования. С помощью одного этапа секвенирования они могли определить, какие штаммы выжили и вызвали у мышей инфекцию.
"Это очень эффективный способ отключить отдельные гены и выяснить, какие из них важны", - объяснила Кимми. Система также позволила исследователям оценить критическую фазу инфекции, когда большинство бактерий погибает погибает из-за стресса, вызванного иммунным ответом. Лишь небольшое количество бактерий выживает в этом "бутылочном горлышке" и продолжает вызывать инвазивные заболевания. "Легкие на самом деле очень хорошо справляются с инфекцией", - говорит Кимми. "Даже когда мы давали мышам довольно большую дозу бактерий, всегда было "бутылочное горлышко" и в кровоток попадало лишь незначительное количество бактерий ".
Исследователи подсчитали, что всего 25 бактериальных клеток могут выжить в "бутылочном горлышке" и вызвать заболевание. Они также обнаружили удивительную вариативность "горлышка", несмотря на то, что мыши были генетически идентичны и были инфицированы с помощью тщательно контролируемого протокола. Эффект "бутылочного горлышка" перекрыл эффект выключения генов, в результате чего разница между контрольными мышами и мышами, у которых бактериальные гены были выключены, была незначительной.
Хотя мыши были генетически идентичны и инфицировались по тщательно контролируемому протоколу, не было закономерности в том, какие штаммы проходят через «горлышко», а его «ширина» сильно варьировала. Кимми отмечает, что очень интересно наблюдать эту вариабельность в контролируемых условиях, ведь и клиническое течение бактериальной пневмонии у людей сильно различается. Было бы важно узнать, какие варианты иммунного ответа лучше всего сокращают популяцию бактерий.
Затем исследователи добавили в систему грипп, инфицировав мышей вирусом гриппа А до введения S. pneumoniae. У мышей, предварительно инфицированных гриппом, не было никакого "горлышка", а относительно небольшая доза бактерий вызывала бурную инфекцию в лёгких. Это позволило оценить влияние выключения генов на вирулентность бактерий.
Результаты показали, что несколько генов играют важную роль в развитии пневмококковых инфекций, в том числе гены, идентифицированные как факторы вирулентности в предыдущих исследованиях, такие как гены бактериальных капсул. Удивительно, но ген основного токсина бактерии - пневмолизина - не оказался необходимым для развития инфекции. Вместе с другими недавними открытиями это говорит о том, что пневмолизин может быть важнее для трансмиссии, чем для выживания в организме хозяина, говорят исследователи.
Загадочным аспектом инфекций S. pneumoniae является то, что это очень распространенный оппортунистический патоген дыхательных путей, не вызывающий заболевания у большинства людей.
"Мы действительно не знаем, что контролирует это", - сказала Кимми. "Похоже, что существует большое количество людей, которые колонизированы, и обычно это не имеет последствий. Но вирусная инфекция может предрасположить их и увеличить риск бактериальной пневмонии."
Чтобы лучше понять вариативные результаты, показанные этим исследованием, ученые планируют использовать CRISPRi для более детального изучения прогрессирования инфекций. В клинических условиях вариабельность прогрессирования болезни может быть объяснена широким спектром факторов. В этом контролируемом исследовании сам процесс инфицирования представлялся весьма вариабельным. "Система, которую мы применили, дала очень элегантный способ показать вариабельность развития инфекции и возможность возникновения случайных вариантов развития инфекций, даже в контролируемой системе", - отметила она.
