Синтетическая микробиота кишечника представляет собой микробные консорциумы, собранные in vitro и предназначенные для имитации определенного микробного состава и функциональных характеристик.
Синтетическое микробное сообщество должно отражать большую часть соответствующего набора микробов, обитающих в кишечнике, что позволяет изучать в контролируемой среде поведение микроорганизмов и их взаимодействие. Такой подход в сочетании с гнотобиологией (исследованиями с участием животных, выращенных в отсутствие микроорганизмов или в присутствии известных штаммов или сообществ микроорганизмов) предоставил большую часть информации о биологической значимости кишечной микробиоты. Если коротко, гнотобиология позволяет выделять и анализировать специфическое воздействие отдельных групп микробов на здоровье хозяина, обмен веществ и иммунитет, что невозможно в системах с естественной колонизацией.
Помимо понимания биологической роли кишечной микробиоты, синтетическая микробиота может быть использована в медицинских целях, начиная с реколонизации после дисбактериоза, вызванного антибиотиками, заболеваниями или другими факторами. Однако этот подход может пойти еще дальше, став терапевтической мерой, направленной на достижение конкретных целей, выполнение особых биохимических действий или регулирование определенных функций организма-хозяина с помощью нервных или эндокринных путей. В этом отношении синтетическая биология может предоставить инструменты для генетического манипулирования микроорганизмами, что позволяет некоторым из них выполнять желаемые функции. Например, модифицированные бактерии используются в качестве живых терапевтических агентов для доставки в кишечник различных биомолекул, таких как бактериоцины, ферменты, цитокины, аллергены и биоактивные пептиды. Модифицированные бактерии могут улучшить коммуникацию с хозяином, модулируя определенные биологические системы.
Генетически модифицированные пробиотики демонстрируют техническую осуществимость этого подхода, однако этические, нормативные и технические вопросы создают значительные трудности. Что касается технических вопросов, то не все бактерии поддаются генетическому манипулированию, по крайней мере, с помощью современных методов. В этом обзоре мы приводим оценку потенциала разработки генетически модифицированной синтетической микробиоты для использования в здравоохранении.
Генетически модифицированные бактерии (GMB) описываются как способные эффективно продуцировать гетерологичные (чужеродные) белки или молекулярные соединения для выполнения определенной функции после генетической модификации. В связи с этим можно перечислить три основных типа генетической модификации: инсерция, делеция и замена гена. Для генетических манипуляций можно использовать несколько технологий рекомбинации, включая традиционные подходы, такие как бактериальная искусственная хромосома (BAC), перенос конъюгатов, транспозиционная рекомбинация и инфицирование фагами.
BAC - это большой фрагмент ДНК, обычно от 100 до 300 т.п.н., предназначенный для введения в бактерии для размножения в виде кольцевой искусственной хромосомы. Однако этот метод ограничен использованием Escherichia coli в качестве основы и предполагает перенос ДНК между бактериями при прямом контакте через конъюгативные пили. Конъюгация - это широко распространенный процесс переноса ДНК, присущий как грамотрицательным, так и грамположительным бактериям, который обеспечивает возможность генной инженерии комменсальных кишечных бактерий. С другой стороны, системы транспозиционной рекомбинации используют относительно простые механизмы, включающие транспозазу и сайт-специфичные рекомбиназные ферменты, которые облегчают основные процессы расщепления ДНК и последующие реакции присоединения; эти механизмы "вырезания и вставки" в консервативных фракциях ДНК могут привести к ряду сложных перестроек ДНК. Наконец, фаговая инженерия предполагает использование содержащих вирусы генно-инженерных фагов, вводимых в бактериальную клетку-хозяина, чтобы убить ее или изменить экспрессию ее генов, манипулируя таким образом ее функциональностью.
Хотя эти подходы дают ценную информацию для микробиологической инженерии, они часто отнимают много времени, ограничиваются несколькими микробами и не могут быть адаптированы для создания синтетической микробиоты. Инструменты генетического редактирования нового поколения, такие как нуклеазы цинкового пальца (ZFN), эффекторные нуклеазы, подобные активаторам транскрипции (TALEN) и CRISPR-Cas9, еще больше продвинули эту область вперед. Однако ZFN и TALEN являются дорогостоящими, требуют много времени и могут вызывать неспецифические мутации.
CRISPR-Cas, с другой стороны, является эффективным и гибким методом инженерии бактерий, использующим систему бактериальной защиты, которая защищает от проникновения вирусной ДНК. Он состоит из трех этапов: распознавания, расщепления и репарации. На этапе распознавания белок Cas9 связывается с единственной направляющей РНК (sgRNA) с последовательностью из 20 пар оснований, комплементарной гену-мишени, располагая ее рядом с мотивом, смежным с протоспейсером. Это помогает белку Cas9 направлять белок к гену-мишени. Введение комплекса CRISPR-Cas9 в клетку приводит к образованию двухцепочечных разрывов (DSBs) в определенном месте генома. Учитывая, что большинство архей и, по крайней мере, половина известных бактерий имеют тот или иной вариант защитной системы CRISPR-Cas, это, пожалуй, самая адекватная технология на сегодняшний день для генетического улучшения синтетической кишечной микробиоты.
Хотя на данный момент идентифицировано шесть типов CRISPR-Cas и 29 подтипов, консервативные последовательности мотивов, прилегающих к протоспейсеру, у всех бактерий позволяют нуклеазам Cas расщеплять ДНК-мишень и являются важным фактором, который следует учитывать при разработке специфичных для мишени направляющих РНК. Одним из преимуществ CRISPR-Cas перед интегративными методами с использованием плазмид является меньший риск потери встроенного генетического материала в случае успеха.
Недавние достижения продемонстрировали возможность генетического манипулирования кишечной микробиотой с использованием технологий, основанных на CRISPR, в терапевтических целях. Так, одно исследование модифицировало пробиотические дрожжи Saccharomyces boulardii для биосинтеза β-каротина (предшественника витамина А) непосредственно в кишечнике мышей, продемонстрировав возможность использования живых микроорганизмов для локализованного и устойчивого производства питательных микроэлементов в желудочно-кишечном тракте. Генетически модифицированный штамм Lactococcus lactis, экспрессирующий человеческий фермент ADH1B, усиливал метаболическое превращение алкоголя в ацетат, что приводит к снижению уровня ацетальдегида в крови и уменьшению повреждения печени у животных, подвергшихся воздействию алкоголя. Для повышения биобезопасности синтетические кишечные микроорганизмы были оснащены "выключателями" на основе CRISPR, которые уничтожают сами себя в определенных экологических ситуациях, гарантируя регулируемую устойчивость в организме хозяина. В совокупности эти исследования подчеркивают перспективность CRISPR в модификации микроорганизмов кишечника для прецизионной медицины и профилактики заболеваний. Однако на данном этапе разработки информация по этой технологии ограничена.
Практическое применение в этой области сводится к модификации отдельных штаммов, включая, например, разработку Escherichia coli для обнаружения воспаления кишечника и реагирования на него, служащего в качестве биосенсора для определения воспалительных заболеваний кишечника. Например, Riglar и соавт. (2017) создали синтетическую генетическую схему в кишечной палочке, которая регистрирует воспалительные сигналы в кишечнике, что позволяет проводить неинвазивный мониторинг болезненных состояний у мышей. Кроме того, E. coli была генетически модифицирована для производства ферментов, расщепляющих фенилаланин, который помогает бороться с фенилкетонурией, редким нарушением обмена веществ. Isabella и соавт. (2018) продемонстрировали эффективность этого метода на доклинических моделях, внеся свой вклад в разработку SYNB1618, живого биотерапевтического препарата, который прошел клинические испытания на людях.
Эти тематические исследования демонстрируют многообещающий потенциал генно-инженерных кишечных микробов в распознавании, регистрации и терапевтическом реагировании на физиологические состояния своих хозяев, и даже когда эти подходы основаны на модификации одного штамма, они подчеркивают важность разработки модульных штаммов, которые могут быть собраны в стабильные, функциональные консорциумы с синергетическими функциями, тем самым формулируя правки по одному штамму как основополагающие шаги на пути к созданию синтетического сообщества.
Хотя для мышиной модели было разработано несколько синтетических образцов кишечной микробиоты путем объединения метааналитических исследований кишечной микробиоты с помощью биоинформатических методов и методов культивирования, общим знаменателем является то, что все они основаны на наборе отдельных бактерий, ранее выделенных и очищенных из образцов кишечника модельного животного. При таком междисциплинарном подходе синтетическая биология может помочь добиться того, что эти микроорганизмы смогут синтезировать метаболиты, имеющие биологическое значение. Таким образом, терапевтические возможности могут быть расширены за счет генной инженерии набора микробов.
Генетическая модификация синтетической кишечной микробиоты может дать несколько интригующих преимуществ, в том числе :
1. Профилактика и лечение заболеваний: этот подход позволяет проводить целенаправленную терапию с использованием модифицированных микробов, которые могут продуцировать определенные соединения или вытеснять вредные бактерии;
2. Улучшенное пищеварение и усвоение питательных веществ: измененные микробы могут эффективно расщеплять питательные вещества и клетчатку, улучшая общее пищеварение;
3. Производство терапевтических соединений: модифицированные микробы могут производить такие соединения, как витамины, аминокислоты и противовоспалительные средства;
4. Лечение психического здоровья: балансируя гормоны и нейромедиаторы, некоторые модифицированные микробы могут гипотетически облегчить проблемы психического здоровья, такие как депрессия и тревога;
5. Персонализированная медицина: этот гипотетический подход может позволить внедрение специализированных микробов, приспособленных для выполнения определенных функций в конкретных условиях.
Бактерии и дрожжи, включая молочнокислые бактерии и Saccharomyces cerevisiae, два комменсала микробиоты человека, являются наиболее изучаемыми микробами в микробной инженерии. Молочнокислые бактерии, включая человеческие пробиотики, являются подходящими микробами-носителями для генной инженерии в терапии. Они были разработаны для выполнения антибактериальных/противовирусных функций и лечения рака путем создания “противораковых вакцин” и обеспечения защиты от канцерогенеза и окислительного повреждения желудочно-кишечного тракта. Кроме того, были индуцированы метаболические возможности, особенно для лечения диабета и ожирения.
В этом отношении микробиота мышей и человека имеет сходные типы кишечных микробов, причем доминирующими группами являются Bacteroidetes и Firmicutes. Примечательно, что система CRISPR-Cas обычно обнаруживается у лактобактерий, принадлежащих к роду Firmicutes. Таким образом, учитывая успешные генетические манипуляции с пробиотиками и при условии подтверждения того, что система CRISPR-Cas обнаружена в коллекции бактерий, используемых для создания синтетической микробиоты, группа лактобацилл может стать хорошей отправной точкой для разработки. Однако, несмотря на потенциальную техническую осуществимость этой стратегии и появление усовершенствованных систем редактирования генов, важно предварительно наблюдать как ведут себя модифицированные бактерии в гнотобиотических моделях. Такой подход позволяет определить, дает ли модификация им конкурентное преимущество перед остальными, что приводит к нежелательному или вредному доминированию и, следовательно, вызывает дисбактериоз или другие неблагоприятные последствия.
Генную инженерию следует проводить только на комменсалах кишечника, поскольку добавление некомменсальных GMB сопряжено с высоким риском неудачи и опасностью из-за проблем биологической несовместимости. В связи с этим генетическая модификация кишечной микробиоты представляет как потенциальные преимущества, так и риски. С другой стороны, это может открыть новые возможности для лечения заболеваний, улучшения пищеварения, выработки полезных веществ, содействия раннему развитию организма и регулирования иммунной системы. Однако такие модификации сопряжены со значительными трудностями и рисками.
Основной проблемой является стабильность внесенных генетических изменений, поскольку микробы могут быстро эволюционировать и потенциально возвращаться к своему прежнему состоянию. Кроме того, горизонтальный перенос генов вызывает серьезные проблемы, поскольку модифицированные гены могут передавать свои свойства другим видам микроорганизмов или даже клеткам хозяина, что приводит к непредсказуемым последствиям. Кроме того, могут возникнуть непредвиденные экологические последствия, которые нарушат работу сложных сообществ в кишечнике или нанесут вред здоровью хозяина непредвиденным образом. Однако при создании синтетических микробных сообществ возникают также особые проблемы. Это экологическая стабильность, конкуренция между штаммами, пространственное структурирование, кворум сенсинг и горизонтальный перенос генов. Поэтому объединение методологий для профилирования сообщества (например, секвенирование 16S рРНК, метагеномика и моделирование метаболических сетей) имеет решающее значение для подтверждения функциональности синтетической микробиоты и ее взаимодействий in vivo.
Хотя информация о рисках генетической модификации синтетической кишечной микробиоты скудна, тематические исследования искусственных пробиотиков уже дают предупреждения. Например, в исследовании PROPATRIA у пациентов, страдающих тяжелым острым панкреатитом, которым вводили мультивидовой пробиотик, наблюдался более высокий уровень смертности по сравнению с группой плацебо, что указывает на потенциальный риск у пациентов в критическом состоянии. Кроме того, были зафиксированы редкие, но документально подтвержденные случаи сепсиса и бактериемии, связанных со штаммами пробиотиков, такими как Lactobacillus rhamnosus, у лиц с ослабленным иммунитетом. Дополнительные опасения связаны с возможностью переноса генов; например, в ходе исследования в коммерческих пробиотических продуктах, предназначенных для животных, были обнаружены гены устойчивости к противомикробным препаратам, некоторые из которых были расположены на плазмидах, что повышало риск горизонтального переноса генов. Эти результаты подчеркивают необходимость тщательной оценки безопасности генетически модифицированных пробиотиков и синтетической кишечной микробиоты.
Этические соображения играют центральную роль в разработке генетически модифицированной микробиоты, требуя особого внимания к безопасности, осознанному согласию и равноправному доступу. Не менее важным является создание надежной нормативно-правовой базы, включая стандартизированную оценку рисков, мониторинг после внедрения и международное сотрудничество для обеспечения согласованности и трансграничной безопасности. В будущих исследованиях приоритетное внимание должно уделяться долгосрочным исследованиям по оценке воздействия искусственных микробов на здоровье хозяина и динамику микробиоты. Мультиомические подходы могут дать более глубокое представление о микробных взаимодействиях и профилях безопасности. Необходимы также инвестиции в такие функции биобезопасности, как дезактиваторы и усовершенствованные инструменты для редактирования генов.
Рекомендуется разработать структурированную дорожную карту:
(1) валидация с помощью лабораторных моделей и моделей на животных,
(2) одобренные с этической точки зрения пилотные клинические испытания,
(3) обмен данными в открытом доступе для обеспечения прозрачности и
(4) постоянное совершенствование нормативных рекомендаций.
Привлечение общественности и просвещение будут иметь важное значение для укрепления доверия и продвижения ответственных инноваций. Согласовывая научные исследования, политику и этические соображения, мы сможем безопасно продвигать применение генетически модифицированных пробиотиков в медицине и биотехнологии.
