Антимикробная резистентность (AMR) представляет собой эволюционный эффект давления отбора антимикробных препаратов в контексте короткого клеточного цикла бактерий, приводящий к адаптации путем естественного отбора с помощью различных молекулярных механизмов.
В настоящее время рассматривается несколько клинических стратегий борьбы с кризисом AMR. Одна из них основана на непрерывной разработке новых антимикробных препаратов для опережения эволюции бактерий, однако сама по себе эта стратегия не является ни научно, ни экономически жизнеспособной. Другая стратегия основана на сохранении существующего арсенала антимикробных средств путем строгого управления и регулирования, что по-прежнему трудно реализовать повсеместно. Третий вариант, являющийся частью системы управления, заключается в совершенствовании диагностики, включая более быстрые методы определения чувствительности к антимикробным препаратам (AST), которые позволяют более точно подбирать схемы антибиотикотерапии для пациентов. Вероятно, потребуется сочетание этих и других подходов, таких как вакцинация, поскольку ни одна стратегия в настоящее время не представляет собой полного решения во всех ситуациях.
Существующие AST обеспечивают фенотипическое количественное определение минимальной ингибирующей концентрации (МИК) выбранного антибиотика для изолятов, культивируемых от инфицированных пациентов, и могут быть дополнены целевыми анализами нуклеиновых кислот для известных детерминант резистентности. AST также может предшествовать видовая идентификация (например, с помощью MALDI-ToF).
К недостаткам современных методов бактериальной идентификации и AST можно отнести необходимость выделения клинических патогенов из культур, наличие специалистов-операторов и лабораторного пространства, а также стандартное время ожидания результатов - 18-24 ч от момента взятия пробы до получения результатов, хотя все более широкое распространение получают платформы для определения AST, основанные на быстром росте (например, Accelerate's Pheno System, SPECIFIC REVEAL® Rapid AST System). Таким образом, первоначальные схемы назначения антимикробных препаратов пациентам обычно имеют широкий спектр действия, что может максимально усилить побочные эффекты на уровне пациента, такие как нарушение микрофлоры кишечника, и способствовать селекции и распространению AMR как на уровне пациента, так и на уровне популяции.
Существует множество новых подходов к повышению скорости выполнения AST, включая биосенсоры, геномные анализы и гибридизационные подходы; однако большинство из них все еще находятся на стадии разработки и пока не нашли практического применения. Многие из этих методов оценивают всю бактериальную культуру, и отсутствие специфичности к отдельным клеткам делает их нечувствительными к гетерогенности клеточных популяций, например, к наличию персистирующих клеток или полимикробных смесей.
Потенциальным решением этой проблемы является использование методов AST, специфичных для одной клетки, которые решают проблему гетерогенности и одновременно обеспечивают более высокую производительность, оценивая эффект антимикробных препаратов непосредственно на клетках, а не полагаясь на вторичные маркеры, такие как рост всей культуры. Было предложено несколько таких AST-кандидатов, для которых используются такие платформы, как проточная цитометрия, спектроскопия комбинационного рассеяния света, флуоресцентные зонды в капельных микрофлюидных устройствах, импедансная цитометрия и другие.
Дополнительные возможности для оценки AST отдельных клеток открываются благодаря их интеграции с широкопольной микроскопией, что увеличивает пропускную способность, позволяя в реальном времени одновременно наблюдать за большим количеством отдельных клеток. Такая визуализация клеток позволяет получать богатые, объемные, неструктурированные данные, которые хорошо подходят для анализа на основе машинного обучения, в частности, с помощью современных методов глубинного обучения. Эти методы с большим успехом использовались для создания моделей расчета AST на основе геномных и метаболомных данных, где их способность выполнять собственную инженерию признаков позволяет максимально эффективно использовать сложные неструктурированные данные. Аналогичным образом глубинное обучение было применено к широкопольной микроскопии для создания кандидатных AST, которые обеспечивают фенотипическую количественную оценку путем мониторинга роста одиночных клеток или паттернов движения в присутствии антибиотиков.
Другой микроскопический метод основан на непосредственной оценке влияния антимикробных препаратов на клеточные структуры, такие как бактериальный нуклеоид или клеточная мембрана. Эти структуры были охарактеризованы экспериментально и вычислительно и использовались как одноклеточные фенотипы для профилирования цитологических механизмов с целью понимания способа действия антибиотиков, а также для тестирования на резистентность к метициллину у Staphylococcus aureus.
С тех пор был установлен широкий спектр цитологических фенотипов нуклеоидов и клеточных мембран при различных условиях воздействия для ряда грамположительных и грамотрицательных видов. Такой подход к фенотипированию имеет значительные преимущества перед методами микроскопии отдельных клеток, отслеживающими рост или движение: результаты можно получить на временном интервале одного жизненного цикла бактерий, а не нескольких, метод применим к труднокультивируемым патогенам, и нет необходимости в непрерывном отслеживании отдельных живых клеток во времени. Однако на клеточное фенотипирование может влиять фенотипическая пластичность, при которой небольшие генотипические и экологические различия могут сильно влиять на проявляемый фенотип.
В данной работе мы представляем новый метод определения чувствительности бактерий к антибиотикам с помощью микроскопии, основанный на использовании фенотипов отдельных клеток, который в принципе может устранить некоторые недостатки существующих анализов. Мы объединяем фенотипы нуклеоида и клеточной мембраны отдельных клеток с современными конволюционными нейронными сетями (CNN) для разработки метода, основанного на глубинном фенотипировании отдельных клеток, которые демонстрируют различный физиологический ответ на антибиотики.
CNN имеют иерархическую структуру обучаемых сверточных фильтров, что позволяет эффективно обучаться на гетерогенных данных визуализации без ручной настройки признаков, устраняя основное "узкое место" предыдущих работ. Наша платформа Deep Antimicrobial Susceptibility Phenotyping (DASP) использует широкопольные микрофотографии для быстрой классификации клеток, обработанных антибиотиками, как чувствительных или резистентных.
Мы разработали специфические модели для четырех антибиотиков, каждый из которых относится к семейству антибиотиков с различным способом действия: фторхинолон ципрофлоксацин (направлен на синтез ДНК), аминогликозид гентамицин (направлен на синтез белка), бета-лактам ко-амоксиклав (направлен на синтез клеточной оболочки) и рифампицин (направлен на синтез РНК).
Мы показали, что наши модели отличаются надежностью в отношении фенотипической пластичности, обучив их на лабораторном штамме Escherichia coli, а затем успешно применив на нескольких клинических изолятах E. coli с различными МИК ципрофлоксацина, где мы смогли выделить бактерии, демонстрирующие изменения клеточного фенотипа в ответ на фиксированную концентрацию ципрофлоксацина. Применяя наш подход на клеточных популяциях шести штаммов E. coli, полученных при инфекциях кровотока человека с различной степенью резистентности к ципрофлоксацину и обработанных различными концентрациями ципрофлоксацина, мы показали, что фенотипирование отдельных клеток может дать информацию, эквивалентную анализу AST, основанному на культивировании, но всего за 30 мин.
Наш подход может быть расширен, чтобы стать более масштабируемым и избежать необходимости предварительного культивирования. В настоящее время этот метод используется для исследования культивированных клинических изолятов, что пока не позволяет сократить время, необходимое для выделения и выращивания микроорганизмов из образцов пациентов. Перед обработкой изоляты культивируются до постоянной концентрации OD600 ~0,2, что соответствует количеству колониеобразующих единиц (КОЕ) ~108, что значительно превышает количество КОЕ, встречающееся в инфицированных физиологических жидкостях организма.
Мы предполагаем, что использование микрофлюидики позволит обойти этапы выделения и культивирования патогенов, изолируя и концентрируя бактерии из образцов пациентов. Наконец, наш метод можно совместить с быстрой идентификацией видов бактерий, которая осуществляется с помощью различных методов, таких как направленное окрашивание FISH.
