Диагностика, основанная на движении бактерий, геномике и машинном обучении, может помочь в преодолении глобального кризиса резистентности к антибиотикам.
В 2007 году Маха Фархат провела несколько месяцев, ухаживая за пациентами в больнице в Дурбане, Южная Африка. Многие из них были инфицированы ВИЧ. Но инфекция, которая занимала ее сознание, была не вирусом, а бактерией: Mycobacterium tuberculosis. В частности, ее беспокоили штаммы, резистентные к распространенным антибиотикам.
Хотя люди с ослабленным иммунитетом особенно восприимчивы к туберкулезу, эта инфекция не является уникальной для людей с ВИЧ: в 2019 году M. tuberculosis унесла 1,4 миллиона жизней по всему миру, 208 000 из которых были ВИЧ-инфицированы. "Туберкулез был ненадолго вытеснен COVID-19, но он по-прежнему является главной инфекционной болезнью, убивающей людей во всем мире", - говорит Фархат, ныне врач и биоинформатик в Гарвардском университете в Бостоне, штат Массачусетс. Устойчивые к лекарственным препаратам формы туберкулеза вносят основной вклад в эту проблему.
Резистентные к лекарствам патогены всех типов вызвали кризис устойчивости к антибиотикам, который угрожает общественному здравоохранению, сельскому хозяйству, животноводству и многим другим отраслям. Но выявить эти штаммы и определить эффективные методы лечения непросто. В странах с ограниченными ресурсами трудно найти лаборатории, оборудованные для работы с особо заразными патогенами, такими как M. tuberculosis, а приборы для тестирования чувствительности к лекарствам могут выдавать результаты в течение нескольких дней. Во многих случаях врачи проводят тест на устойчивость только после того, как один или несколько стандартных антибиотиков не помогают. Во время ожидания пациенты могут получить ненужный или неэффективный курс антибиотиков или покинуть клинику без лечения.
Фархат и другие исследователи обращаются к таким инструментам, как атомно-силовая микроскопия, геномика и машинное обучение, чтобы создать диагностические тесты, которые, как они надеются, будут выдавать результаты в считанные минуты, сводя к минимуму использование неправильных или ненужных рецептов. "Увеличение скорости - это самый важный шаг вперед", - говорит клинический микробиолог Евгений Иделевич из Университетского медицинского центра Грайфсвальда в Германии.
Золотой стандарт метода оценки восприимчивости микробов к антибиотикам, известный как метод разведений, датируется 1889 годом. Компании автоматизировали этот же принцип в приборах для определения чувствительности к антимикробным препаратам, таких как BD Phoenix от BD Biosciences и VITEK 2 от bioMérieux. На проведение анализов на этих приборах обычно требуется от 4 до 8 часов, хотя получение результатов может занять день или более, поскольку клиницисты должны отправлять образцы в лаборатории клинической микробиологии.
Но исследователи также используют методы анализа, которые чаще ассоциируются с физическими науками, чем с микробиологическими лабораториями. Например, в 2018 году Иделевич разработал миниатюрную версию теста, которая основывается на MALDI-TOF, масс-спектрометрической технике для идентификации молекул на основе их массы и заряда. Иделевич и его коллеги поместили микрокапли культур двух патогенов - Pseudomonas aeruginosa и Klebsiella pneumoniae - непосредственно на твердую матрицу, используемую для MALDI-TOF, и инкубировали каждую каплю с различным лекарственным препаратом. Затем они проанализировали образец с помощью системы, специально разработанной для идентификации бактерий: MALDI Biotyper от Bruker Daltonik. Интенсивность характерных спектральных пиков указывала, были ли культуры восприимчивы или резистентны к антибиотику.
В 2013 году Джованни Лонго из Национального исследовательского совета Италии в Риме и его коллеги обнаружили, что когда они связывают патогенные Escherichia coli с миниатюрными структурами, похожими на доску для дайвинга, называемыми кантилеверами, и подвергают их воздействию антибиотиков, кантилевер покачивается вверх и вниз из-за небольших движений прикрепленных живых бактерий. Движения прекращались, если микробы были чувствительны к антибиотикам. Движение было заметно под атомно-силовым микроскопом в течение нескольких минут - задолго до размножения микроорганизмов. Это означает, что тест может идентифицировать живые бактерии гораздо быстрее, чем это возможно с помощью метода, основанного на наблюдении за ростом бактерий.
Рейчел МакКендри, исследователь нанотехнологий из Университетского колледжа Лондона, и ее тогдашняя аспирантка Изабель Беннетт хотели применить этот подход в клинике. Но прикрепить бактерии к кантилеверам длиной 200 микрометров в чашке Петри оказалось легче сказать, чем сделать. "Только часть кантилеверов прикрепляла бактерии, а иногда они были либо слипшимися, либо их было слишком мало", - рассказывает Беннетт. Работая с коллективом Лонго над точной настройкой процесса, Беннетт обнаружила большие различия в отраженном свете, что позволило предположить, что подобные движения бактерий можно заметить даже тогда, когда микробы не были прикреплены к кантилеверам. Поэтому команда изменила тактику: они изменили конструкцию, чтобы отслеживать бактерии, когда они плавают по поверхности структур. Они сделали кантилеверы из твердого, отражающего материала и разработали программное обеспечение для анализа движения бактерий таким образом, чтобы показания были пропорциональны количеству бактерий в растворе. "Этот обманчиво простой механизм оказался действительно хорошим способом обнаружения резистентности по сравнению с существующими методами", - говорит МакКендри.
Хотя система еще не коммерциализирована, она может быть адаптирована и расширена для клинического использования, считает Беннетт. Отражающие поверхности можно превратить во вставки, помещаемые в обычно используемые микротитровальные планшеты, а атомно-силовой микроскоп заменить на оптический ридер DVD-плеера для регистрации сигнала. "Потенциально это может быть очень простая и недорогая установка", - говорит она.
Физик Камиль Экинчи из Бостонского университета в Массачусетсе ищет другой способ определения устойчивости бактерий к антибиотикам - электрический ток. Его группа поместила образец мочи с бактерией K. pneumoniae, распространенной причиной инфекций мочевыводящих путей, непосредственно в один канал микрофлюидного устройства с антибиотиком и отследила электрическую проводимость по каналу. "Если бактерии растут и забивают канал, они создают большее электрическое сопротивление", - говорит Экинчи. "По сути, мы преобразуем рост бактерий в электрический сигнал". Преимущество, добавляет Экинчи, заключается в том, что электрический сигнал легче усилить и визуализировать, чем микроскопические изображения. "В принципе, наша методика может обнаружить одно бактериальное деление", - говорит он, хотя и добавляет, что метод может работать не для всех бактерий, особенно для таких медленно растущих патогенов, как M. tuberculosis.
Измерение молекулярных маркеров
Тесты, основанные на росте бактерий, просты, дешевы и неспецифичны: один тест подходит для широкого спектра патогенов. Но поскольку результаты теста зависят от условий роста и использования правильной концентрации антибиотиков, "все остальное является недостатком", - говорит Сюзанна Хойслер, изучающая медицинскую микробиологию в Ригсхоспитале в Копенгагене. В качестве альтернативы Хойслер и другие специалисты обращаются к геномике в поисках подсказок для выявления устойчивости к лекарствам. Это "независимое от культуры тестирование" - следующий большой шаг в этой области, говорит эпидемиолог София Ку из Гарвардского университета.
Гены, которые четко связаны с механизмами антибиотикоустойчивости, - идеальный путь к быстрой диагностике, поскольку не требуют длительного инкубирования бактерий, говорит исследователь инфекционных заболеваний Гэри Школьник из Стэнфордского университета в Калифорнии. Но важно знать, какие последовательности в геноме бактерий важны для резистентности к лекарствам, говорит Томас Грайс, клинический микробиолог из клиники Майо в Фениксе, штат Аризона. "В противном случае можно легко пропустить новый механизм или обнаружить фрагмент гена, который на самом деле не обеспечивает резистентность".
Школьник также является директором по медицинским вопросам в Visby Medical, калифорнийской компании, которая в 2020 году выиграла 19 миллионов долларов США в рамках проекта по диагностике устойчивости к противомикробным препаратам, спонсируемого Национальным институтом здравоохранения США. Тест компании представляет собой одноразовый диагностический point-of-care тест, проводимый с помощью простого ручного устройства, для выявления лекарственной устойчивости у возбудителей инфекций, передающихся половым путем, таких как Neisseria gonorrhoeae. Анализ нацелен на мутации, которые придают устойчивость к ципрофлоксацину, широко используемому пероральному антибиотику для лечения гонококковых инфекций. Мутации в гене, кодирующем фермент гиразу А, определяют разницу между штаммами Neisseria, резистентными или восприимчивыми к ципрофлоксацину.
Тесты на основе ПЦР для выявления таких вариантов имеют ограниченное применение в клиниках из-за необходимости в инструментах, реагентах и технических специалистах, обученных проведению реакций. Диагностика Visby обходит эти ограничения, сводя анализ к простому изменению цвета. Амплифицированные фрагменты попадают в камеру прибора, содержащую зонды для захвата каждого варианта гена. В результате связывания происходит изменение цвета, которое отражает чувствительность или резистентность штамма к ципрофлоксацину. Другие продолжают изучать секвенирование всего генома, чтобы охватить спектр вариантов, которые обеспечивают резистентность. Однако разработка недорогих и быстрых тестов на основе такой информации остается сложной задачей.
"Дело не только в наличии гена резистентности, но и в его экспрессии",
- говорит Николь Уилер, специалист по обработке данных из Бирмингемского университета (Великобритания), изучающая подходы машинного обучения к геномике. "Чем больше транскриптомных и протеомных данных мы соберем, тем больше у нас шансов улучшить наши возможности по прогнозированию резистентности", - говорит Уилер.
Методы, основанные исключительно на секвенировании генома, хорошо работают для некоторых патогенов, таких как Salmonella enterica, но мутации в многочисленных регуляторных генах могут изменить паттерны экспрессии генов (и, следовательно, резистентность) у других, включая P. aeruginosa. "В принципе, все транскриптомные данные находятся в геноме", - говорит Хойслер. "Но иногда проще посмотреть на транскриптом, чем искать все возможные мутации, которые изменяют экспрессию генов".
Например, в 2014 году Чикара Фурусава, биоинженер из RIKEN в Осаке, Япония, изучал лабораторные штаммы E. coli, адаптирующиеся к росту в присутствии различных антибиотиков, и обнаружил, что он может использовать изменения в экспрессии генов для более точного прогнозирования резистентности, чем с помощью самих последовательностей геномной ДНК. "Корреляция между экспрессией генов и резистентностью была значительно выше, чем между резистентностью и геномными маркерами", - говорит Фурусава.
Прогнозирование развития резистентности
В своей работе Хойслер и ее коллеги остановились на сочетании геномных и транскриптомных маркеров как на лучшей "сигнатуре" для прогнозирования устойчивости к антибиотикам у P. aeruginosa. Но чтобы улучшить свою модель, они обратились к машинному обучению. Вместо того чтобы просто выявлять мутации, способствующие резистентности, они использовали свои алгоритмы для определения сигнатуры вариаций ДНК и РНК, которые предсказывают резистентность штамма к антибиотикам. Алгоритм помогает определить только ключевые признаки - он не станет частью возможного диагностического теста, говорит Хойслер. Тем не менее, такие подходы могут решить проблему выявления всех комбинаций "микроб - антибиотик" только с помощью генома, говорит Уилер.
Эти алгоритмы могут не просто информировать врачей о текущем профиле резистентности патогена, но и показать, какие механизмы резистентности к антибиотикам могут развиться у штамма в ответ на лечение. Тем не менее, "решить, стоит ли доверять алгоритму или нет, довольно сложно", - говорит Уилер.
"Это черные ящики. Даже если у вас есть весь код и все данные, вы не всегда знаете, что побуждает модель утверждать, что образец А устойчив, например, к азитромицину".
По словам Уилер, еще одна проблема, над решением которой работают специалисты, - чрезмерная подгонка: алгоритм может "запомнить множество неважных особенностей" данных, вместо того чтобы научиться находить истинные корреляции. Поскольку последовательности бактериальных генов могут быть очень похожими, инструменты машинного обучения могут слишком упростить проблему и сделать неверные выводы. Уилер сравнивает эту проблему с ошибочным поиском изображений: алгоритм, обученный на множестве фотографий сельскохозяйственных животных в полях, может определить фотографию открытого пространства как овцу. Бактерии часто передают друг другу гены устойчивости к антибиотикам на небольших кольцевых участках ДНК, которые не являются частью их генома. "Но поскольку остальная часть генома остается неизменной, алгоритм может сказать, что штамм по-прежнему чувствителен", - говорит она. "Что мы действительно хотим от этих моделей, так это изучить биологию резистентности".
Учитывая ограничения, связанные с изучением и тестированием туберкулеза, Фархат применила подход машинного обучения, который использует целые последовательности генома для составления прогнозов. В апреле она и ее коллеги описали веб-инструмент под названием GenTB, который может предсказать резистентность к нескольким противотуберкулезным препаратам. Эффективность инструмента зависит от качества входных данных о последовательностях и от конкретного препарата. По словам Фархат, в то время как одна распространенная мутация вызывает до 80% резистентности к препаратам первого ряда, используемым для лечения туберкулеза, несколько редких вариантов дают небольшой прирост резистентности к препаратам второго ряда. "Иногда устойчивость проявляется только при наличии нескольких таких мутаций".
Какой бы подход ни использовали разработчики, перед исследователями стоит одна и та же фундаментальная задача: разработать диагностику, значительно превосходящую существующие приборы. По словам Грайса, нынешние тесты уже могут предоставлять результаты врачам менее чем за 24 часа по цене в один-два доллара за тест. "Вопрос не в том, хорош ли тест", - говорит он. "Вопрос в том, лучше ли он того, что мы имеем сейчас? Важно определить траекторию, которая поможет нам достичь поставленных целей".
Некоторые разрабатываемые тесты ограничены по видам образцов, которые они могут анализировать, или по бактериям или антибиотикам, которые они могут тестировать. Например, диагностика Visby в настоящее время ограничена гонококковыми инфекциями, а микрофлюидное устройство анализирует только образцы мочи и не может работать с инфекциями, вызванными более чем одним видом бактерий. Другие приборы, требующие современных микроскопов или спектрометрии, такие как кантилеверы, необходимо адаптировать, прежде чем они смогут использоваться неспециалистами, работающими в клиниках с ограниченными ресурсами по всему миру.
Поскольку многие из этих подходов тестируют один или два микроорганизма против нескольких препаратов, они покорили лишь "вершину айсберга", говорит Алекс ван Белкум, директор по микробиологическим исследованиям компании bioMérieux. "Между этими технологиями и автоматизированными системами тестирования чувствительности к антибиотикам, которые в настоящее время используются в лабораториях, все еще существует большое отставание".
Как и в случае пандемии COVID-19, во время которой экспресс-тесты оказались решающим фактором для выявления и остановки распространения вируса, недорогие диагностические средства, используемые в пунктах оказания медицинской помощи, необходимы для снижения злоупотребления антибиотиками, говорит МакКендри.
" Резистентность к противомикробным препаратам - это очень сложная проблема, и новые тесты - это только одна часть решения".
