Лихорадка неизвестной этиологии (ЛНЭ) может быть вызвана различными заболеваниями.
Сообщается о более чем 200 причинах ЛНЭ (Horowitz, 2013). В 1961 году Petersdorf и Beeson первыми определили ЛНЭ как состояние лихорадочного заболевания в течение более 3 недель, с температурой тела более 38,3°C в течение нескольких эпизодов и неопределенным диагнозом после 1 недели стандартного обследования и лечения в стационаре (Petersdorf и Beeson, 1961).
В 1991 году Durak и Street переопределили ЛНЭ на четыре группы: " классическая", "нозокомиальная", "нейтропеническая" и "связанная с вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ)". Они предложили три амбулаторных визита и соответствующие исследования в качестве альтернативы "1 неделе госпитализации" (Durack and Street, 1991).
В 1997 году Arnow и Flaherty обновили определение ЛНЭ и посчитали, что "минимальная диагностическая оценка для квалификации ЛНЭ" должна быть следующей: всесторонний сбор анамнеза; повторное физикальное обследование; полный анализ крови (включая дифференциальный анализ и подсчет тромбоцитов); обычный биохимический анализ крови (включая лактатдегидрогеназу, билирубин и печеночные ферменты); анализ мочи (включая микроскопическое исследование); рентгенография грудной клетки; скорость оседания эритроцитов (СОЭ); антинуклеарные антитела; ревматоидный фактор; ангиотензин-конвертирующий фермент; рутинный анализ крови (×3) при отсутствии приема антибиотиков; иммуноглобулин-М антитела к цитомегаловирусу или обнаружение вируса в крови; анализ на гетерофильные антитела у детей и молодых взрослых; туберкулиновый кожный тест; компьютерная томография (КТ) брюшной полости или радионуклидное сканирование; антитела к ВИЧ или анализ на обнаружение вируса; дальнейшая оценка отклонений, выявленных вышеуказанными анализами (Arnow and Flaherty, 1997).
Из-за сложных клинических характеристик и отсутствия лабораторных показателей заболевания диагностика ЛНЭ затруднена и способствует высокой стоимости госпитализации. Инфекции, новообразования, неинфекционные воспалительные заболевания и другие состояния - это четыре основные этиологические группы ЛНЭ (Mourad et al., 2003). Сбор подробного анамнеза и проведение обследований для определения причин лихорадки имеют решающее значение. Стандартный процесс диагностики и лечения ЛНЭ еще не предложен, но при проведении обследования и диагностики они должны выполняться в определенном порядке.
Выявление патогенных бактерий имеет решающее значение для целенаправленной антиинфекционной терапии. У пациентов с длительной лихорадкой эмпирическая терапия не рекомендуется, поскольку она может маскировать симптомы, задерживать постановку диагноза и затруднять принятие решений относительно оптимального лечения (Unger et al., 2016). Существует лишь несколько исключений, когда лечение должно быть начато только на основании диагностических подозрений: антибиотики при культурально-отрицательном эндокардите, туберкулостатики при активном туберкулезе и глюкокортикоиды при височном артериите с риском потери зрения (Bryan and Ahuja, 2007).
Микробиологические культуры и анализы биологических жидкостей являются обычными для микробной диагностики, но такие культуры и анализы оказываются положительными только в ∼40% случаев. Кроме того, проведение и интерпретация культур крови требуют времени, что задерживает получение информации клиницистами. Чувствительность и специфичность обнаружения на основе ПЦР основывается на геномной последовательности известных патогенных бактерий, дает ограниченную информацию и является неоптимальной для выявления микст-инфекций. Ошибки при приеме препаратов или задержки в терапии могут возникнуть из-за ограничений клинического тестирования.
По данным двух систематических обзоров, проведенных с 1995 по 2004 год (Gaeta et al., 2006) и с 2005 по 2015 год (Fusco et al., 2019), инфекции являются основной причиной ЛНЭ. Необходимо разработать скрининговые и диагностические процессы для выявления патогенов, вызывающих ЛНЭ, обусловленных инфекциями.
Количественное метагеномное секвенирование следующего поколения (Q-mNGS) является современным методом выявления возбудителей ЛНЭ, обусловленных инфекциями. Количественное метагеномное секвенирование следующего поколения, также известное как "высокопроизводительное секвенирование" или "массивное параллельное секвенирование", - это тип технологии, позволяющий одновременно и независимо секвенировать от сотен до миллиардов фрагментов ДНК (Morganti et al., 2019).
Q-mNGS имеет множество применений в клинических микробиологических исследованиях и обеспечивает беспристрастный метод обнаружения патогенов. Недавние исследования показали, что Q-mNGS можно использовать для диагностики различных инфекционных заболеваний, включая COVID-19 (Ren et al., 2020), пневмонию, вызванную инфекцией Chlamydia psittaci (Chen et al., 2020), инфекцию вируса Эбола (EBOV) (Li et al., 2019) и таларомикоз (Shi et al., 2021).
Революция в секвенировании ДНК: от секвенирования Сэнгера к количественной метагеномике. Секвенирование следующего поколения.
Первое поколение технологии секвенирования генов родилось с появлением метода терминации цепи, описанного Сэнгером и Коулсоном (1975), и метода деградации цепи, описанного Максамом и Гилбертом (1977). Гилберт и Сэнгер построили первый секвенатор в 1977 году и использовали его для секвенирования первого полноразмерного генома фага X174, содержащего 5 375 оснований (Maxam and Gilbert, 1977; Aoyama et al., 1981). Секвенирование первого поколения может получить сиквенс из 700-1000 оснований за один раз, поэтому оно не может удовлетворить насущную потребность в расшифровке сиквенсов генов.
После революции в традиционной технологии секвенирования, технология секвенирования второго поколения, известная как "секвенирование следующего поколения" (NGS), может быть использована для получения сиквенсов от сотен тысяч до миллионов молекул нуклеиновых кислот за один прогон. С помощью NGS можно очень детально исследовать транскриптомы и геном того или иного вида. Джонатан Ротберг создал биотехнологическую компанию 454 Life Sciences в 2005 году, впоследствии появились другие технологии, такие как секвенирование путем олигонуклеотидного лигирования и детекции (SOLiD) (Applied Biosystems) и Solexa (Illumina). В 2007 году компания Roche приобрела 454 Life Sciences.
Основные принципы этой технологии заключаются в том, что фрагмент ДНК не нужно флуоресцентно маркировать, нет необходимости в электрофорезе, а сиквенс изменяется в процессе синтеза. При добавлении основания к сиквенсу удаляется пирофосфатная группа, поэтому пиросеквенирование также известно как обнаружение пирофосфатных оснований. Секвенирование по технологии SOLiD основано на лигазном секвенировании. Технология Solexa (которая также используется для секвенирования путем синтеза) была впервые разработана компанией Illumina и в настоящее время используется в секвенаторах второго поколения, разработанных компанией Illumina.
Метагеномика (также известная как "микробная экологическая геномика") создает метагеномную "библиотеку" путем прямого извлечения ДНК или РНК всех микроорганизмов из образцов окружающей среды и их изучения с помощью стратегий геномных исследований. Метагеномика на основе NGS стала центром клинических исследований после развития технологии секвенирования генов.
Q-mNGS - это метод анализа генетического материала микроорганизмов и хозяев из образцов пациентов для диагностики инфекционных заболеваний. Q-mNGS стал центром клинических исследований благодаря быстрому развитию технологии секвенирования генов.
Технология секвенирования третьего поколения включает в себя платформы Pacific Bioscience и Oxford Nanopore, которые являются одномолекулярными технологиями. Одномолекулярное секвенирование (которое не требует ПЦР-амплификации и теоретически может определять последовательности нуклеиновых кислот любой длины) наиболее эффективно по сравнению с технологиями секвенирования первого и второго поколений.
Количественное метагеномное секвенирование следующего поколения при ЛНЭ или инфекционных заболеваниях
Диагностическая ценность NGS была изучена в ретроспективных исследованиях для пациентов, страдающих лихорадкой. Эффективность обнаружения при помощи NGS оказалась выше, чем у традиционных методов.
Fu et al. (2021) провели ретроспективное исследование 175 пациентов с ЛНЭ для сравнения Q-mNGS с культурой и традиционными методами, включая мазки, серологические тесты и амплификацию нуклеиновых кислот (традиционная ПЦР, Xpert MTB/RIF и Xpert MTB/RIF Ultra). По сравнению с культуральным и традиционным методами, авторы пришли к выводу, что Q-mNGS крови может увеличить общую частоту обнаружения новых организмов на 22,9 и 19,79%, и повысить диагностическую эффективность на 38,0 и 32,0%, соответственно.
Zou и др. (2022) обследовали 12 пациентов с туберкулезом после трансплантации почки, и Q-mNGS оказалась эффективной в 67% случаев.
Benamu et al. (2021) оценили 55 пациентов с фебрильной нейтропенией, чтобы сравнить результаты анализа культуры крови и стандартного микробиологического исследования в течение 24 ч после начала лихорадки и каждые 2-3 дня. Чувствительность и специфичность теста секвенирования внеклеточной ДНК микроорганизмов составили 85% (41/48) и 100% (14/14), соответственно. Расчетное время до постановки диагноза в целом было короче при использовании KT (87%). По мнению специалистов, результаты KT в режиме реального времени позволили провести раннюю оптимизацию антимикробных препаратов у 47% пациентов.
Liu et al. (2020) ретроспективно оценили 17 пациентов, которым была проведена трансплантация легких. Доля бактерий, обнаруженных в легких доноров, составила 52,9 и 35,3% с помощью NGS и бактериальной культуры, соответственно. NGS оказался более чувствительным для обнаружения бактерий, чем классическая бактериальная культура.
Reyes и соавторы провели ретроспективное исследование 38 пациентов. У восьми из 38 пациентов (21%) все вирусные патогены, выявленные 42 традиционными анализами, были также обнаружены с помощью Q-mNGS, а у двух пациентов (5%) Q-mNGS выявил дополнительные патогены.
NGS дает больше информации, чем обычные диагностические тесты. Xiao et al. (2020) первыми систематически исследовали меж- и внутрииндивидуальные вариации SARS-CoV-2 с помощью ампликонного и улавливающего секвенирования всего генома; это также было первое сравнительное исследование с использованием нескольких методов. Исследование показало, что сверхвысокопроизводительное метатранскриптомное (мета) секвенирование позволяет выявить богатую генетическую информацию в клинических образцах, помимо SARS-CoV-2, и дает рекомендации для клинической диагностики и терапии.
В июне 2020 года Управление по контролю за продуктами и лекарствами США выдало разрешение на экстренное использование Q-mNGS теста на COVID-19 производства компании Illumina, что стало первым подобным разрешением для NGS-диагностики.
Li et al. (2019) продемонстрировали, что Q-mNGS образцов, собранных в полевых условиях, можно использовать для восстановления девяти геномов из вспышки EBOV в Боэнде (Демократическая Республика Конго) в 2014 году (покрытие >50%), обнаружения EBOV с высокой глубиной секвенирования 17,3 ± 4,7 SD миллионов чтений с чувствительностью, сравнимой с ПЦР, и выявления сопутствующих инфекций от хорошо распознаваемых (Plasmodium falciparum) и новых/необычных (например, вирус Орунго) патогенов.
Jerome et al. (2019) проспективно обследовали 40 вернувшихся путешественников с лихорадкой (≥38°C), образцы плазмы которых были секвенированы: у 11 из 40 пациентов была диагностирована вирусная инфекция. С помощью Q-mNGS были выявлены пять вирусных инфекций, которые также были выявлены при стандартной диагностике, но у двух пациентов, инфицированных вирусом чикунгунья, и у одного пациента с вирусом паротита диагноз был поставлен только с помощью Q-mNGS.
Williams et al. (2018) исследовали виром плазмы крови в случаях необъяснимого лихорадочного заболевания в Танзании с 2013 по 2014 год методами секвенирования. Последнее может помочь в обнаружении вирусных коинфекций, например, почти полных геномов вируса денге-2 и пестивируса человека.
Horiba et al. (2021) проанализировали 87 пациентов с лихорадочной нейтропенией. Предполагаемые патогены были обнаружены с помощью Q-mNGS у 17,2% пациентов, но у всех были отрицательные культуры крови.
Методы выявления патогенов (например, ПЦР) требуют от клиницистов сначала заподозрить конкретную бактериальную инфекцию, прежде чем проводить соответствующее выявление. Однако технология NGS может быть использована для обнаружения патогенных бактерий в образцах пациентов с высокой чувствительностью, тем самым предоставляя рекомендации для клинического лечения.
Часто NGS проводилось без использования структурированного диагностического протокола и на разных стадиях ЛНЭ. Zhu et al. (2021) обнаружили, что использование Q-mNGS для крови в качестве исследования первой очереди может повысить частоту диагностики ЛНЭ на 10,9% по сравнению с использованием культуры, а использование Q-mNGS в качестве исследования второй очереди может повысить частоту диагностики сопутствующей инфекции на 66,7 и 12,5% для инфекций, не связанных с кровотоком. В конечном итоге, стоимость диагностики ЛНЭ может быть снижена за счет применения Q-mNGS, поскольку диагноз будет поставлен на ранней стадии, так как не будут проводиться ненужные и дорогостоящие диагностические исследования.
Chai et al. (2018) исследовали соотношение затрат и выгод от применения Q-mNGS при ЛНЭ, когда причина не была найдена, несмотря на соответствующие исследования. Было создано дерево решений для систематического описания затрат и выгод, связанных с внедрением NGS. Каждый диагностический протокол составлялся до тех пор, пока исследование первой или второй линии не давало положительного результата. NGS вводился в этот протокол в качестве дополнения к исследованиям первой или второй очереди. Авторы сообщили о применении NGS в качестве исследования первой очереди, предполагая, что вероятность нахождения причины экономической эффективности во всех случаях составляет ≥60%, используя удельные затраты на диагностические тесты и процедуры в сингапурских долларах в 2016 году. В этом анализе при использовании рационального пакета тарифов для исследования второй очереди общая ожидаемая стоимость использования NGS в качестве исследования второй очереди была выше, чем при использовании его в качестве исследования первой очереди. Хотя в этом анализе не учитывались затраты, связанные с продолжительностью госпитализации, более быстрые и точные ответы, которые дает NGS, могут обеспечить дополнительную экономию средств.
Q-mNGS является чувствительным методом диагностики ЛНЭ и может стать рутинной процедурой в диагностике ЛНЭ. Q-mNGS представляется экономически эффективной при ЛНЭ, поскольку позволяет избежать ненужных исследований и сократить продолжительность госпитализации.
