Картирование микробиома кишечника
Препарирование кишечника вомбатов - не самый простой способ получить представление о том, что происходит с их микробиомом, однако именно так поступили аспирант Университета Аделаиды Рафаэль Айзенхофер и его коллеги в рамках недавнего исследования.
(Вомба́товые, или во́мба́ты (лат. Vombatidae), — семейство сумчатых млекопитающих из отряда двурезцовых, обитающих в Австралии. Вомбаты — роющие норы травоядные животные, внешне напоминающие маленьких медведей или гигантского хомяка - прим.пер.).
Собирать какашки было бы проще - особенно для исчезающих видов, таких как вомбаты, но исследователи хотели получить больше информации, чем можно было получить из образца кала.
"Мы уже давно используем фекалии, потому что их очень легко получить, но то, что мы знаем о микробной экологии, говорит о том, что все дело в местоположении - где именно микробы находятся в интерфейсе хозяина", - объясняет Айзенхофер.
Он и его соавторы охарактеризовали микробную биогеографию, или пространственную информацию о том, какие микробы где присутствуют, в желудочно-кишечном тракте (ЖКТ) одного голого носатого вомбата (Vombatus ursinus) и одного южного волосатоносого вомбата (Lasiorhinus latifrons). Айзенхофер признает ограничения, связанные с использованием только двух вомбатов, однако команда все же обнаружила некоторые удивительные факты. Например, у обоих животных в дистальном конце толстой кишки возле ануса обитало менее 20 % видов микроорганизмов из проксимального конца тонкой кишки. "Я думал, что там будет гораздо большее совпадение", - говорит Айзенхофер. И сообщества, обнаруженные в проксимальной части толстой кишки каждого из животных, были более похожи друг на друга, чем на сообщества в дистальной части толстой кишки того же животного.
Полученные ими результаты пополняют растущее число работ ученых, которых волнует не только то, какие микроорганизмы присутствуют в кишечнике, но и то, где эти микробы находятся и с какими клетками хозяина и другими микроорганизмами они взаимодействуют. Выявленные на сегодняшний день различия в микробных сообществах в разных частях кишечника указывают на то, что микробная биогеография может иметь функциональные последствия. Эти открытия также свидетельствуют о том, что исследования микробиома, основанные только на образцах кала, могут дать неполную картину сообществ внутри кишечника.
Если бы исследователи хотели изучить биоразнообразие речной экосистемы, но делали это, глядя только на животных в конце реки, они бы упустили все, что происходит выше по течению, объясняет Каролина Тропини, изучающая микробиоту кишечника в Университете Британской Колумбии в Канаде. В области микробиома "мы пытаемся описать невероятно сложную среду, просто взяв образец кала, а кал - это действительно только то, что выходит из реки", - говорит она. "И на практике все биологически интересные вещи не происходят в конце реки".
Не ограничиваясь образцами кала
Одним из примеров несоответствия между информацией, получаемой из фекалий, и тем, что на самом деле происходит внутри кишечника, является исследование, опубликованное в 2019 году. Авторы оценивали членов микробного сообщества из кишечных крипт - углублений кишечной стенки - у людей со здоровой толстой кишкой и людей с колоректальным раком. Помимо различий в микробах в опухолевых и здоровых участках, авторы обнаружили, что около трети видов, присутствующих в здоровых криптах, относятся к филуму Proteobacteria (переименованному в Pseudomonadota), однако этот филум составляет лишь около 1 % видов, обычно обнаруживаемых в кале.
"Люди, изучавшие экологию рек, всегда ценили одно: то, что происходит выше по течению, часто влияет на то, что происходит ниже по течению", - говорит Грегори Дональдсон, постдок, изучающий влияние иммунной системы на комменсальные микробы в Университете Рокфеллера. "Вы можете измерить это, но вы не сможете понять, почему река такая, какая она есть, если не подниметесь вверх по течению и не выясните, что происходит наверху".
Чтобы раскрыть информацию, отсутствующую в образцах кала, Тропини и ее коллеги визуализируют и анализируют микробы, присутствующие в кишечнике, в режиме, максимально приближенном к реальному времени. Основная проблема заключается в том, что трудно заглянуть внутрь такого хорошо защищенного места, как кишечник, объясняет она. Обычно приходится прибегать к эвтаназии животных-моделей, а для людей требуется биопсия различных участков ЖКТ, чтобы исследовать эти ткани и связанные с ними микроорганизмы. Но подготовка к биопсии обычно включает в себя прием слабительного, которое очищает желудочно-кишечный тракт и может исказить результаты. По словам Тропини, это эквивалентно торнадо, несущемуся вниз по реке.
Хотя Тропини добилась успеха в разработке методов, позволяющих сохранить слизистый слой и микробиоту образцов желудочно-кишечного тракта для визуализации без применения слабительных, в настоящее время она также увлечена использованием микрофлюидики для моделирования среды кишечника и фиксации динамики его биогеографии в реальном времени. Эти так называемые устройства "кишечник-на-чипе" позволяют исследователям поместить эпителиальные клетки человека или мыши на прозрачный чип, где они производят слизь, а затем ввести бактерии и наблюдать, как микробы взаимодействуют с клетками кишечника. Группа Дональда Ингбера из Гарвардского университета использовала этот подход для успешного культивирования микробов и клеток кишечника человека на подобных чипах в течение нескольких дней.
"Это, безусловно, очень уменьшенная модель, - допускает Тропини, - но если, например, вы пытаетесь смоделировать влияние измененного потока внутри кишечника и то, как это влияет на прикрепление бактерий, вам нужно сделать это, наблюдая в реальном времени". Взятие биопсии или препарирование желудочно-кишечного тракта животного, с другой стороны, дает только один снимок во времени. Еще одним преимуществом стратегии культивирования на основе чипов является возможность создания градиентов кислорода, которые позволяют анаэробным и аэробным микробам расти так, как они росли бы в кишечнике, сообщила группа Ингбера.
Понимание взаимоотношений между соседями
Помимо физических факторов, влияющих на микробов-соседей, микробы сами влияют друг на друга. Чтобы узнать больше об этих взаимоотношениях, эволюционный биолог Корри Моро из Корнельского университета и ее группа оценили присутствие микроорганизмов в четырех областях кишечника у различных видов муравьев-черепах (род Cephalotes).
По ее словам, изучение присутствующих в кале микроорганизмов "дает вам представление обо всем, что происходит, но вы не можете понять: есть ли у вас какая-то бактерия, которая процветает в неправильном месте? Нет ли у вас войны между видами?". У муравьев "мы фактически входим с часовыми щипчиками под микроскопом и осторожно препарируем каждый отдел кишечника, чтобы получить изображение бактерий, связанных с ним на протяжении всего пищеварительного тракта".
Моро и ее коллеги обнаружили, что в средней кишке доминирует только одна группа бактерий, в то время как в задней кишке сообщество более разнообразно. Когда исследователи изучили геномы бактерий в этих двух местах, они обнаружили, что микробы, живущие в изоляции в средней кишке, потеряли все гены для ведения войны с другими бактериями. Напротив, бактерии в задней кишке сохранили гены для производства антибиотиков, которые необходимы для защиты своего пространства от других микробов. Полученные результаты указывают на то, что в этом отсеке происходит "некая борьба за лучшее положение", - объясняет Моро, - что может повлиять и на хозяина.
Чтобы еще более пристально изучить микробное соседство в кишечнике, Харрис Ванг из Медицинского центра Колумбийского университета и его коллеги разработали метод секвенирования, вдохновленный методами, используемыми в экологии. "Как изучить пространственную организацию в лесу? Это очень сложно, потому что там много деревьев, много кустарников, много животных, и вы не можете сосчитать всех до единого", - объясняет Ванг. Поэтому "вы отгораживаете небольшой участок [и используете существующие] аналитические инструменты для изучения различий между этими участками".
Группа Ванга иммобилизует образцы ЖКТ или фекалий в геле, чтобы зафиксировать их пространственное расположение на месте, затем разбивает гель на крошечные участки диаметром около 30 микрон и маркирует ДНК в каждом участке уникальным штрих-кодом. После секвенирования они могут воссоздать карту того, какие именно виды микробов где присутствуют и кто их соседи. В желудочно-кишечном тракте мыши они обнаружили, что виды микробов имеют разных соседей в зависимости от того, где они находятся в кишечнике. И когда исследователи перевели мышей с низкожировой диеты на высокожировую, изменился не только микробный состав в кишечнике, но и пространственная организация микробов: после смены диеты у бактерий появились более разнообразные соседи.
По словам Харриса, понимание соседства и взаимоотношений микроорганизмов является "ключом к следующему поколению лучшего понимания микробиоты и того, как она может способствовать всем тем видам пользы, которые нас интересуют".
Клетки-хозяева - это еще один тип соседей микроорганизмов, который исследователи, занимающиеся биогеографией, не могут игнорировать. Например, в исследовании, опубликованном в январе, авторы показали, что у мышей с истощенными иммунными клетками микробиота была более разнообразной и равномерно распределялась по регионам кишечника по сравнению с мышами с нормальной иммунной системой.
Это взаимодействие между микробами и хозяином было в центре внимания Дональдсона с тех пор, как он был аспирантом Саркиса Мазманяна в Калифорнийском технологическом институте. Дональдсон, Мазманян и их коллеги обнаружили, что комменсальные микробы используют иммуноглобулин А (IgA), антитела хозяина, содержащиеся в слизи, для колонизации кишечника. Напротив, IgA затрудняет патогенным организмам закрепиться в желудочно-кишечном тракте.
Исследователи также показали, что в толстой кишке безмикробных мышей человеческий комменсальный микроб Bacteroides fragilis изменяет экспрессию своих генов в зависимости от того, находится ли он вблизи эпителия хозяина, в просвете кишечника или в слизи. Эти и другие результаты указывают на двустороннюю связь между хозяином и микроорганизмами, но именно эта двунаправленность делает изучение этих взаимодействий таким сложным, отмечает Дональдсон. Не всегда ясно, направляют ли микробы поведение клеток хозяина, или клетки хозяина диктуют, где могут находиться микробы и что они делают.
По словам Мазманяна, исследователи, изучающие микробиом, хорошо научились использовать секвенирование ДНК для составления профиля членов микробного сообщества. "Секвенирование - довольно простая часть", - объясняет он. "Что, на мой взгляд, мы не очень хорошо делаем в этой области... так это понимание того, что делают организмы, когда они там находятся. Какие продукты они производят? Какие гены они включают? Как они вовлекают клетки, будь то эпителиальные клетки, иммунные клетки или нейроны кишечника?".
Независимо от того, изучают ли исследователи 30-микронные микробные кварталы или получают представление о биогеографии всего кишечника, один из главных открытых вопросов, по словам Моро, заключается в том, влияет ли ориентация этих бактерий в пищеварительном тракте на здоровье хозяина. Следующим шагом, объясняет она, будет "разделение этих тонких взаимодействий" и выяснение того, изменяет ли изменение биогеографии состояние здоровья.
Если да, то биогеография может иметь важные последствия для применения таких методов лечения, как фекальная трансплантация и антибиотики. При попытке внедрить микробные сообщества в кишечник, например, при лечении инфекции C. difficile, пространственная организация может быть важным фактором, объясняет Ванг. Если комменсальные микробы "обычно существуют в каком-то микробиальном регионе, который является очень стабильным и прочным, возможно, вам действительно нужно перемещать весь этот регион", и неясно, достигает ли этого фекальная трансплантация, говорит он. А поскольку антибиотики убивают больше микробов, чем патогены, против которых они предназначены, лекарственные препараты могут влиять на способность соседних штаммов к выживанию.
По словам Ванга, важно понять, "как взаимосвязаны эти сообщества в пространстве и как различные изменения окружающей среды меняют это".
