В течение 500 лет после того, как сифилис был впервые описан в Европе, никаких успехов в специфической лабораторной диагностике достигнуто не было.
Только вскоре после начала XX века немецкий зоолог Фриц Шаудинн и дерматолог Эрих Хоффман впервые обнаружили этиологический агент заболевания - Treponema pallidum - в тканях больных. После идентификации T. pallidum ученые знали, на что следует обратить внимание при разработке тестов для диагностики сифилиса. Ниже представлено фото спирохет T. pallidum в инфицированной ткани яичка, окрашенных серебром модифицированным методом Штайнера. Возможно, это не совсем то, что видели Шаудинн и Хоффман, но это хороший пример того, как ткань может быть инфицирована большим количеством спирохет при исследовании под микроскопом.
Спирохеты Treponema pallidum в образце ткани яичек кролика, приготовленном с использованием модифицированного метода окрашивания серебром по Штайнеру.
В 1906 году произошел значительный прорыв в лабораторных исследованиях сифилиса, когда американский иммунолог австрийского происхождения Карл Ландштейнер, который всего за несколько лет до этого произвел фурор в области гематологии своим открытием групп крови, вместе со своим коллегой-дерматологом Виктором Мухой ввел использование микроскопии темного поля для выявления присутствия сифилитических трепонем в зараженных образцах.
Австрийский ученый Карл Ландштейнер. Фото: en.wikipedia.org
Эта новая методика стала важным достижением, но в конечном итоге продемонстрировала значительные ограничения. Прямое обнаружение с помощью микроскопии достаточно хорошо работает при первичном сифилисе с чувствительностью около 80%, так как большое количество трепонем часто видно в образцах ткани из шанкра.
Однако чувствительность темного поля снижается по мере прогрессирования инфекции, а также может снижаться, если пациент получал антибиотики местного действия. Кроме того, этот метод микроскопии нельзя использовать для визуализации трепонем в образцах, собранных изо рта, поскольку во рту обитает множество видов непатогенных трепонем, морфологически неотличимых от T. pallidum, что приводит к ложноположительным результатам.
Трепонемы также могут быть обнаружены в образцах, собранных с неоральных поражений слизистой оболочки и кондилом. Образцы выделений из носа у новорожденных с сифилитическим ринитом, собранные у больных врожденным сифилисом, часто изобилуют трепонемами, которые также легко визуализируются с помощью микроскопии в темном поле. В шапке статьи представлено фото, сделанное с использованием техники визуализации в темном поле, демонстрирующая наличие спирохет T. pallidum.
Чувствительность прямой визуализации в значительной степени зависит от правильного сбора образцов, который включает получение серозного экссудата из очагов поражения, избегая крови или гноя, которые могут находиться рядом или даже на поверхности очага поражения, с последующим помещением собранных образцов на предметное стекло, которое должно быть исследовано с помощью темнопольного микроскопа в течение 20 минут после сбора. Этот метод в основном не используется в повседневной клинической практике из-за необходимости наличия специального микроскопа и обученного микроскописта рядом с местом сбора образцов. В результате большинство медицинских учреждений и клинических лабораторий не имеют возможности проводить этот вид тестирования.
Нетрепонемное тестирование
Примерно в то же время в Германии бактериолог Август Пауль фон Вассерман совместно с двумя дерматологами/венерологами Альбертом Нейссером (в честь которого была названа Neisseria gonorrhoeae) и Карлом Бруком разработали первый серологический тест для диагностики сифилиса. В их работе, опубликованной в 1906 году, использовался метод фиксации комплемента, разработанный бельгийскими учеными Жюлем Борде и Октавом Жангу. (Одно очко тому, кто сможет ответить, какой организм, названный в честь Борде, растет в культуральной среде, разработанной этими двумя микробиологами). Наличие в сыворотках пациентов антител, "специфичных" для сифилиса, которые в то время метко называли антителами Вассермана, приводило к образованию иммунных комплексов и истощению факторов комплемента, в результате чего индикаторные эритроциты оставались неповрежденными (положительная реакция Вассермана). На рисунке ниже показан тест Вассермана и то, как интерпретировать результаты на основе наблюдения за эритроцитами.
Вассерман и его коллеги опробовали несколько различных антигенов для теста, и экстракт печени сифилитического плода оказался гораздо более реактивным по сравнению с другими больными тканями обезьян или человека. При первоначальной оценке анализ был положительным исключительно на сыворотках больных сифилисом, но при дальнейшем тестировании большего количества образцов стала выявляться ложная положительная реакция среди несифилитических людей.
Только в 1907 году Ландштейнер выяснил ранее неизвестный механизм реакции Вассермана путем идентификации липоидных "аутотоксичных" веществ, с которыми антитела Вассермана образуют иммунные комплексы в присутствии лецитина и холестерина. Выявление этих веществ в несифилитических тканях, включая сердце, позволило предположить, что эти антитела, названные Ландштейнером "реагинами", не являются специфичными для T. pallidum; анализ для выявления этих антител, известных сегодня как антифосфолипидные антитела, считался бы тем, что мы сейчас называем нетрепонемным тестом. Позже было обнаружено, что реагины также вырабатываются в ответ на острые или хронические нетрепонемные инфекции, при которых происходит повреждение тканей.
Ложноположительные результаты нетрепонемного теста связаны с рядом несифилитических заболеваний, включая другие инфекции (например, вирус иммунодефицита человека), аутоиммунные расстройства, беременность, иммунизацию, употребление инъекционных наркотиков и пожилой возраст. Несмотря на свои недостатки, тест Вассермана был одним из первых серологических тестов для диагностики инфекционных заболеваний и основой для последующих нетрепонемных тестов для диагностики сифилиса.
В 1940-х годах основное вещество, используемое в качестве антигена в тесте Вассермана, было идентифицировано как дифосфатидиглицерол, называемый кардиолипином, который обычно встречается в нормальных несифилитических тканях, включая сердце. Почему обнаружение антифосфолипидных, нетрепонемных антител может указывать на сифилис, было предметом дебатов в течение последних 6 десятилетий.
Исследование 2018 года с использованием модели инфекции кролика показало, что T. pallidum сама по себе содержит кардиолипиновый антиген, но со слабой иммуногенностью, а активная T. pallidum индуцирует повышенную выработку нетрепонемных антител в организме хозяина. Было высказано предположение, что увеличение выработки антифосфолипидных антител является результатом комбинированного воздействия как кардиолипинового антигена T. pallidum, так и кардиолипинового антигена поврежденной клетки хозяина во время сифилитической инфекции, причем последний, вероятно, играет основную роль в этом процессе индукции.
Антигены, использовавшиеся в старых поколениях нетрепонемных анализов, представляли собой неочищенные экстракты пораженных тканей, обработанные с помощью различных методов экстракции, что затрудняло их стандартизацию. В 1941 году Мэри Пэнгборн и др. опубликовали метод выделения кардиолипина и лецитина из говяжьего сердца. Использование комбинации очищенного кардиолипина, лецитина и холестерина в качестве антигена для тестов на нетрепонемные антитела позволило улучшить стандартизацию анализов и повысить воспроизводимость результатов внутри лабораторий и между ними. В настоящее время для приготовления реагентов для нетрепонемных анализов вместо экстрактов из говяжьего сердца используются синтетические кардиолипин и лецитин.
Другой метод, сыгравший важную роль в развитии анализа на сифилис с использованием нетрепонемных антител, - флокуляция, который был предложен немецкими учеными Гансом Саксом и Вальтером Георги. Флокуляция происходит, когда антигены, используемые в тесте, образуют комплекс с нетрепонемными антителами в образце пациента, что приводит к скоплению антигенов, которое можно наблюдать визуально (макро- или микроскопически). Нетрепонемные тесты, использующие флокуляцию, были гораздо менее трудоемкими, чем те, которые полагались на фиксацию комплемента, все они устарели к 1940-м годам.
Было разработано множество нетрепонемных тестов, основанных на методе флокуляции. Одним из первых флокуляционных тестов первого поколения был тест Хана. В этом тесте, опубликованном в 1922 году, использовался антиген, состоящий из экстракта говяжьего сердца и холестерина, взвешенных в физрастворе. В 1927 году американский бактериолог/патолог Уильям Огастус Хинтон (который впоследствии стал первым профессором-афроамериканцем в Гарвардском университете) описал усовершенствованный флокуляционный тест, в котором антиген, состоящий из холестеринового экстракта говяжьего сердца, был суспендирован в глицеринированном солевом растворе вместо обычного солевого раствора. Этот новый анализ показал увеличение чувствительности по сравнению с тестом Хана, и метод был принят для рутинного тестирования пациентов в течение многих лет. (Второе очко тем, кто назовет название культуральной среды, которую дочь Хинтона, ветеринар Джейн Хинтон, разработала, работая лаборантом в Гарварде).
Чувствительность и простота использования флокуляционных тестов реагинового типа привели к разработке многих других тестов, основанных на аналогичных принципах. К ним относятся реакция преципитации по Прайсу (РПП), реагин в ненагретой сыворотке (USR), автоматизированный реагиновый тест (ART) и тест в ненагретой сыворотке с толуидиновым красным (TRUST). Однако только тест VDRL (Venereal Disease Research Laboratory) и быстрый плазменный реагин-тест (RPR) все еще широко используются в клинических лабораториях.
Анализ на трепонемные антитела
Идентификация T. pallidum как этиологического агента сифилиса позволила ученым разработать диагностические тесты для выявления наличия трепонемных антител. В дополнение к своей работе по идентификации липоидных веществ, которые служат антигеном в тесте Вассермана, Ландштейнер и его коллеги также сообщили, что сыворотка больных сифилисом подавляет движение T. pallidum. Это наблюдение легло в основу теста иммобилизации T. pallidum (TPI), который был введен в 1949 году американскими учеными Манфредом Майером и Робертом Нельсоном. Несмотря на сложные и утомительные процедуры проведения теста, TPI стал одним из первых тестов на трепонемные антитела и был принят в качестве подтверждающего теста для образцов, положительных в нетрепонемных тестах.
Флуоресцентный тест на антитела к сифилису был впервые представлен в 1957 году Диконом, Фальконе и Харрисом. В этом тесте сыворотки пациентов инкубировались на предметных стеклах, содержащих мазки антигена, приготовленные из суспензии инактивированного организма, после чего они промывались и окрашивались конъюгированным с флуоресцеином изотиоцианатом (FITC) антителом. Присутствие трепонемных антител приводит к флуоресценции организма на предметном стекле.
Первое поколение теста имело высокий процент ложноположительных результатов, возможно, из-за перекрестной реактивности с непатогенными видами трепонем. Чтобы снизить уровень ложноположительных результатов, исследователи экспериментировали с дальнейшим разведением образцов, пытаясь снизить неспецифическую реактивность. Однако этот подход был реализован за счет снижения чувствительности анализа. В 1964 году была опубликована процедура FTA с абсорбцией (FTA-ABS). Добавление этапа абсорбции, когда образец предварительно обрабатывался ультразвуковой дезинтеграцией непатогенных трепонем Рейтера, привело к значительному повышению специфичности при сохранении чувствительности анализа. FTA-ABS все еще проводится в некоторых клинических лабораториях в качестве трепонемного теста, но он может давать разные результаты из-за различий в оборудовании, реагентах и субъективной интерпретации.
Анализ на гемагглютинацию Treponema pallidum (TPHA) был представлен в 1966 году Такаюки Томизава и Шигео Касамацу, которые разработали этот тест с целью упростить процесс тестирования на трепонемные антитела. В этом тесте сыворотки пациентов предварительно обрабатывались обычными (несенсибилизированными) овечьими эритроцитами. Предварительно обработанные сыворотки инкубировали с эритроцитами, которые были сенсибилизированы антигеном, полученным из штамма T. pallidum Nichols. Гемагглютинация указывала на присутствие трепонемных антител в образце. Более новое поколение этого теста называется тестом агглютинации частиц T. pallidum (TP-PA). В этом тесте используется тот же антиген, что и в TPHA, но вместо эритроцитов используются желатиновые частицы-носители.
В дополнение к вышеупомянутым тестам, для выявления трепонемных антител было разработано и коммерчески доступно множество иммуноферментных анализов (ИФА) и хемилюминесцентных иммуноанализов (ИХА). Одним из преимуществ ИФА и ИХА является то, что они могут быть автоматизированы для высокопроизводительного скрининга, при этом минимизируя человеческие ошибки и различия между операторами. Интересно, что использование ИФА и ИХА увеличилось за последние несколько лет в связи с принятием алгоритма обратного скрининга на сифилис среди клинических лабораторий.
В дальнейшем было разработано и опубликовано множество ПЦР-анализов, но эти методы не стандартизированы, и ни один из них не доступен на коммерческой основе. Тем не менее, молекулярное тестирование может быть полезным в диагностике врожденного сифилиса, нейросифилиса и раннего первичного сифилиса.
