Сепсис - это тяжелое заболевание, характеризующееся системной воспалительной реакцией организма на инфекцию.
При частоте около 50 миллионов случаев в год сепсис представляет собой значительную проблему для здравоохранения. Смертность среди пациентов с диагностированным сепсисом составляет около 26%, а шансы на выживание резко снижаются, если лечение откладывается. По оценкам, 25-30% случаев сепсиса связаны с инфекциями кровотока. Поэтому быстрое обнаружение и идентификация патогенных микроорганизмов в крови пациента важны для быстрого начала эффективного лечения антибиотиками.
Низкая микробная нагрузка в кровотоке пациентов, составляющая всего от одной до десяти колониеобразующих единиц на мл крови, требует больших объемов анализа крови, что особенно сложно для педиатрических пациентов. Кроме того, для подтверждения наличия бактерий в крови и идентификации их вида обычно требуется от нескольких часов до нескольких дней посева. Такая задержка является проблематичной, учитывая снижение выживаемости пациентов, страдающих септическим шоком, на 8% за каждый час несвоевременного лечения. Тяжесть этого заболевания в сочетании с латентностью доступных методов диагностики означает, что комбинированная терапия антибиотиками широкого спектра действия часто назначается в качестве терапии первой линии немедленно, до получения результатов диагностического теста. Такая практика приводит к неоптимальному лечению, способствует повышению устойчивости к антибиотикам и, как было показано, увеличивает токсичность для печени по сравнению с монотерапией таргетными антибиотиками.
Современные методы идентификации бактерий в крови пациентов с сепсисом можно подразделить на генотипические (например, полимеразная цепная реакция), фенотипические (например, культивирование) или масс-спектрометрические методы (MALDI-TOF). Хотя генотипические методы позволяют идентифицировать бактерии в низких концентрациях без культивирования крови, они не дают информации о чувствительности, что ограничивает клиническое применение. Фенотипический и протеомный подходы обычно требуют более высокой бактериальной нагрузки, что требует посева крови и, следовательно, длительного времени получения результата.
Традиционные методы тестирования на чувствительность к антибиотикам (AST) в клинических условиях основаны на дисковой диффузии или микроразведениях суспензии, что может занять от нескольких часов до суток для получения результатов. Эти методы основаны на чистых культурах, которые требуют двух предыдущих этапов культивирования, что значительно увеличивает общее время обработки до нескольких дней. Новые ускоренные методики значительно сократили этот процесс, позволяя проводить тестирование непосредственно на основе посевов крови и получать результаты всего за 4-8 часов.
Более того, в последние годы был достигнут значительный прогресс в разработке новых методов AST, которые могут быть применены непосредственно к положительным культурам крови. Например, было показано, что такие системы, как PA-100 от SYSMEX, позволяют прогнозировать фенотипическую резистентность положительных культур крови. Существуют также микросхемы на основе 3D-микроэлементов, которые могут выполнять АSТ, используя резазурин в качестве чувствительного зонда. Специфическая АSТ на основе метаболических ферментов, такая как флуоресцентная прижизненная визуализирующая микроскопия (FILM), которая измеряет метаболические нарушения после воздействия антибиотиков, позволяет дифференцировать чувствительные и резистентные бактерии в течение 10-60 минут. Кроме того, существуют специфичные для патогена метаболические ферменты, которые служат надежными биомаркерами АSТ и могут получить данные по АSТ в течение 30 минут.
Появление систем искусственного интеллекта (ИИ) привело к появлению технологий на базе ИИ, которые используют машинное обучение для интерпретации сложных моделей роста, фенотипов на основе изображений или спектральных данных. Алгоритмы искусственного интеллекта, встроенные в такие платформы, как Accelerate Pheno и dRAST, анализируют реакции бактерий в режиме реального времени, повышая точность и сокращая время получения результата до 4-7 часов. Компании Q-linea, Gradientech и QuantaMatrix, предлагают интегрированные решения, способные получать результаты АSТ непосредственно из положительных образцов крови в течение 4-6 часов. Молекулярные платформы AST, такие как FilmArray (bioMérieux) и Verigene (Nanosphere), могут обеспечить идентификацию нескольких видов и узкую панель маркеров устойчивости к противомикробным препаратам. Несмотря на эти значительные достижения, основной проблемой остается время, необходимое для получения положительного посева крови, что может занять несколько дней для некоторых привередливых микроорганизмов. Наш подход направлен на решение этой проблемы.
Фенотипические методы для единичных клеток, которые не требуют культивирования крови, предлагают более быструю альтернативу, но требуют, чтобы бактерии были изолированы от избытка клеток крови хозяина. Выделение бактерий из цельной крови осуществлялось с помощью инерционной и эластоинерционной микрофлюидики, разделения на основе скорости осаждения, фильтрации, химического улавливания, разделения на основе магнитных шариков, диэлектрофореза или акустического разделения. Однако большинство из этих методов выделения отличаются ограниченной производительностью и низкой частотой отторжения клеток крови или были продемонстрированы только при концентрации бактерий 1000 КОЕ/мл или выше, что требует длительного предварительного культивирования бактерий.
В данной работе мы представляем метод выделения бактерий из цельной крови с высокой эффективностью разделения с помощью интеллектуального центрифугирования с последующим улавливанием в микрофлюидном чипе и детекции на основе глубокого обучения, применяемого к микроскопическим изображениям. Мы разработали и протестировали пятиэтапный анализ для выделения и обнаружения бактерий в образцах крови без предварительного культивирования. Мы показали, что можем успешно использовать этот анализ для выявления трех видов бактерий, вызывающих сепсис, - K. pneumoniae, E. faecalis и E. coli, которые охватывают ~20% видов бактерий, вызывающих сепсис, в Европейском Союзе и 35% в Японии.
Общее время анализа составило менее 2 ч, что включало 5 мин для первого центрифугирования, 10 мин для лизирования, 13 мин для второго центрифугирования и 70 мин для улавливания микрофлюидным чипом. Автоматический анализ изображений, основанный на глубоком обучении, выполняется менее чем за 30 секунд для всего набора данных. Текущее время ознакомления составляет ~10 минут. Предполагаемый предел обнаружения в диапазоне 1-10 КОЕ/мл является клинически значимым. По сравнению с предыдущими работами, наш подход не требует посева крови и позволяет выявлять бактерии фенотипически в клинически значимых концентрациях. Однако выявление S. aureus по прежнему остается сложной задачей.
Интеллектуальное центрифугирование - это простой, недорогой, высокопроизводительный и легко распараллеливаемый метод быстрого выделения бактерий из цельной крови с высокой эффективностью выделения бактерий и отторжения клеток крови. Совместимость метода со стандартным лабораторным оборудованием позволяет использовать его в клинических условиях. Бактерии выделяются в небольшом объеме жидкости, аналогичном объему исходной плазмы, что облегчает последующую обработку. Такая быстрая изоляция и выявление представляет собой значительный прогресс в выявлении инфекций кровотока без культивирования.
