Резистентность к противомикробным препаратам (AMR) является одной из основных угроз глобальному здравоохранению и, по оценкам, приведет к 10 миллионам человеческих смертей к 2050 году.
Несмотря на это, многие крупные фармацевтические компании прекратили или сократили свои исследования в области антибиотиков. Гены AMR не новы, они развивались на протяжении миллионов лет и продолжают эволюционировать под воздействием селективного давления, что делает поиск новых антибиотических соединений актуальной задачей. Одним из потенциальных источников новых антибиотиков являются ледяные керны.
Лед служит биологическим хранилищем, обеспечивая запись эволюции микроорганизмов, содержащую биологические образцы, датируемые многими тысячелетиями. Микроорганизмы, приспособившиеся к экстремальным условиям окружающей среды и способные выжить, служат уникальным источником биомолекул, благодаря которым сформировались уникальные физиология и метаболические пути. Эти особенности могут расширить набор вариантов, на которые нацелены антимикробные препараты, и выявить соединения, которые могут быть адаптированы для текущего использования.
Например, различные архитектуры клеточных стенок могут потребовать более сильных антимикробных пептидов, проникающих в бактериальные клетки. Уже было показано, что микробы, адаптированные к холоду, производят антимикробные соединения, что делает их новым ресурсом для поиска молекул для борьбы со штаммами AMR. Кроме того, бактерии, не обязательно приспособленные к холоду, но найденные вмерзшими в лед, также представляют собой возможность для изучения взаимодействия микробов и микроорганизмов, которое можно использовать в терапевтических целях. Так, в образце льда возрастом 13 000 лет были обнаружены AMR и признаки антимикробной активности.
Согласно гипотезе Бааса-Бекинга, микроорганизмы потенциально способны обитать везде, и только конкретные экологические условия определяют, какие организмы обитают в той или иной экосистеме. Мы традиционно занимаемся поиском антимикробных соединений в почве и морской среде, но в меньшей степени в холодных средах, где природа отобрала различные микроорганизмы. В этой статье мы описываем исследовательский процесс, в ходе которого можно извлечь ледяные керны для поиска антибиотических соединений и использовать подходы синтетической биологии для дальнейшей оптимизации аспектов производства, а также дизайна соединений.
Биоразведка ледяных кернов
Потенциальные антимикробные экологические взаимодействия, зафиксированные в ледяных кернах, могут быть выявлены путем изучения генетических записей и попыток культивирования самих микроорганизмов. Антагонистические взаимодействия между организмами в форме отношений хищник-жертва могут оказывать селективное давление на жертву и порождать виды с защитными молекулами, которые потенциально могут обладать антимикробной активностью. Антимикробные препараты также могут быть получены в результате симбиотических отношений, когда один организм выделяет антимикробные соединения, защищающие хозяина от патогенов. Экологические, а также нелетальные, альтернативные эффекты субингибиторных уровней противомикробных препаратов более подробно обсуждались другими авторами. В данной работе мы предлагаем получать эти соединения для терапевтического использования.
В рамках метагеномного анализа ледяного керна (ICEMAN) образцы исследуются с помощью секвенирования и метагеномного подхода, а также с помощью лабораторного культивирования. Протокол на основе секвенирования, названный "обнаружение антибиотиков и анализ метагеномов" (ADAM), может быть выполнен в дополнение к протоколу исследования окружающей среды на основе культивирования (EVE), что позволяет максимально увеличить потенциал для извлечения антибиотических соединений.
ADAM основан на сборке чтений ДНК, которые позволяют создать точную метагеномную репрезентацию. Затем она подвергается изучению с помощью нескольких вычислительных программ, таких как MetaBGC, которые выявляют сигнатуры антибиотических генов. MetaBGC, изначально разработанная для поиска лекарственных препаратов в микробиоме, обнаруживает кластеры биосинтетических генов (BGCs), кодирующих микробные метаболиты на уровне одного чтения, и особенно полезна, когда микробы слабо представлены в метагеномных данных или имеют низкую численность - ситуации, которые, очевидно, применимы для биоразведки в ледяных кернах.
Можно использовать и другие программы, основанные на алгоритмах машинного обучения для выявления антимикробных пептидов. Помимо выявления специальных антибиотических соединений, следует обратить внимание на криптически закодированные пептиды в составе крупных белков. Недавние исследования показали, что такие криптические пептиды могут быть выделены и успешно протестированы против патогенных организмов. ADAM также включает в себя поиск продуктов с учетом биоактивности на основе метагеномных библиотек, что, как было показано, позволяет выявлять метаболически важные белки. В совокупности ADAM позволяет получить список возможных антибиотических соединений на уровне малых молекул и пептидов, которые могут стать кандидатами для экспериментальной проверки.
В то время как подход ADAM опирается на секвенированную генетическую информацию, EVE стремится напрямую исследовать пробы ледяных кернов для поиска сохранившейся микробной жизни, которая может быть метаболически активной при наличии оптимальной среды для роста. Известно, что организмы впадают в криптобиоз из-за неблагоприятных условий окружающей среды. Недавние исследования показали, что нематоды и вирусы из вечной мерзлоты могут быть возрождены и культивированы. С помощью тщательных методов культивирования, включающих подачу соответствующих факторов роста и стимуляции, возрожденные микробы могут быть затем проверены на антимикробные свойства с помощью традиционных антимикробных анализов. В некоторых случаях может потребоваться кокультивирование. Затем интересующие соединения могут быть выделены с помощью методов химической экстракции и охарактеризованы с помощью масс-спектрометрии и ядерного магнитного резонанса. Ожившие организмы также могут быть использованы для создания геномов, пригодных для дальнейшего анализа с помощью инструментов в рамках подхода ADAM.
Методы синтетической биологии
Хотя методы синтетической биологии могут быть использованы для идентификации антимикробных соединений, полученных из ледяных кернов, синтетическая биология также может быть использована для оптимизации антибиотиков против AMR путем разработки и отбора. Перечень кандидатов, составленный на основе ADAM и EVE, представляет собой соединения, представляющие интерес, которые могут быть усовершенствованы путем применения принципов биодизайна и разработки лекарственных препаратов. Многие инновационные методы недавно продемонстрировали свою полезность для высокопроизводительного скрининга соединений на основе пептидов, например, с использованием фагового дисплея или белков внешней мембраны. Эти методы могут помочь в отборе препаратов с низкой токсичностью, высокой эффективностью и низкой иммуногенностью.
Подходы синтетической биологии, такие как экспрессия гетерологичных генов, инженерия метаболизма и пространственное программирование, могут быть использованы не только для получения и идентификации антимикробных соединений, полученных из ледяного керна, но и для увеличения их производства в последующих процессах очистки. Например, потенциальные антимикробные продукты из генетических фрагментов, BGCs или предсказанных генов могут быть получены с помощью индуцибельных промоторов на плазмидах с переменным числом копий, которые вводятся в гетерологичных хозяев. Кроме того, в некоторых случаях, когда продукты токсичны, можно использовать бесклеточные системы. Биосинтез других антимикробных соединений также может зависеть от наличия и оптимизации различных ферментов. Подобные подходы синтетической биологии использовались для производства и инженерии природных продуктов, таких как терпеноиды, алкалоиды, поликетиды, а также нерибосомальные и рибосомальные пептиды.
Заключение
Микроорганизмы в ледяных кернах являются возможным хранилищем новых антимикробных соединений, которые могут быть использованы в нашей постоянной борьбе с AMR. В данном исследовании мы описываем программу ICEMAN, которая включает в себя как последовательный, так и культуральный подходы к идентификации интересующих нас антибиотических соединений ортогональным способом, что позволяет максимально увеличить потенциал для открытия антибиотиков в ледяных кернах. Подходы синтетической биологии могут применяться как для первоначального получения соединений, так и для этапов оптимизации.
В контексте возрождения древних микроорганизмов следует обратить внимание на вопросы биобезопасности и биозащиты. С организмами и вирусами, полученными из образцов тысячелетней давности, следует обращаться осторожно и в соответствии с передовыми методами молекулярной биологии, чтобы обеспечить безопасность не только исследователей, работающих с образцами, но и населения и современной биосферы. Загрязнение окружающей среды неизвестным патогеном может представлять угрозу для здоровья людей, животных и растений. Исследования ICEMAN должны проводиться при соблюдении надлежащего надзора и протоколов работы с ними. ICEMAN использует экологический и генетический потенциал ледяных кернов, и целенаправленные усилия по добыче и определению характеристик антибиотических соединений в этих образцах могут способствовать здоровью и благополучию общества.
