Неочищенные сточные воды все чаще становятся важным объектом наблюдения для анонимного мониторинга больших городских популяций и используются для мониторинга и количественной оценки незаконного потребления наркотиков, резистентности к противомикробным препаратам (AMR), бактериома, вирусома, генетики человеческих популяций, а в последнее время и SARS-CoV-2.
Можно применять различные методологии, но преимущество метагеномики заключается в одновременном получении данных о разнообразном геномном содержимом образцов, что дает возможность одновременно исследовать бактерии, паразитов, вирусы и AMR. Однако метагеномные данные, полученные из неочищенных сточных вод, очень сложны и отражают широкое разнообразие микроорганизмов, выделяемых человеком, а также высокую вариабельность последовательностей (сиквенсов) от растений, животных и неизвестных микробов, что затрудняет идентификацию соответствующих патогенных сигналов.
На состав сточных вод также влияют различные виды бытовых отходов (продукты питания), отходы от людей и внешних источников окружающей среды (почва, грунтовые воды), а также микроорганизмы, размножающиеся в канализационной системе. Бактерии, ассоциированные с фекалиями человека, составляют 15-30% от общего числа микроорганизмов в сточных водах, то есть большая часть микробиома сточных вод поступает из других источников. Многие бактерии, содержащиеся в сточных водах, являются постоянными обитателями канализационной системы и обитают в биопленках (Pseudomonas, Lactococcus, Longilinea, Trichococcus, Acidovorax), на стенках канализационных труб и в отложениях на дне труб (Acrobacter, Acinetobacter, Aeromonas, Trichococcus).
Начиная с 2025 года, Европейский союз намерен внедрить эпиднадзор за сточными водами на очистных сооружениях, обслуживающих 100 000 и более жителей. Для осуществления надежного надзора за AMR в сточных водах человеческих популяций было бы полезно сначала тщательно определить разнообразие микробных сообществ в таких городах, включая новые виды, и изменения в их составе с течением времени. Таким образом мы сможем установить базовые показатели, которые считаются «нормальными», что поможет обнаружить отклонения, свидетельствующие о наличии или возникновении AMR. Идентификация новых видов микроорганизмов также очень важна, поскольку они могут быть носителями неизвестных генов резистентности, что может привести к появлению новых источников AMR. Поскольку бактерии окружающей среды по своей природе обладают многочисленными генами AMR, определение происхождения этих генов имеет жизненно важное значение для целенаправленного мониторинга генов AMR, связанных с деятельностью человека.
Предыдущие исследования показали, что микробный состав сточных вод может демонстрировать значительную изменчивость как во временном, так и в пространственном отношении в пределах одной и той же канализационной системы. Кроме того, могут существовать различия в составе и сезонности микробов в разных географических регионах. Эти источники вариаций проявляются во временном масштабе от нескольких недель до нескольких месяцев. Наконец, в сравнении образцов сточных вод важными могут считаться многие факторы, включая температуру, поступление дождевой воды и численность населения, которые вносят свой вклад в состав сообществ конкретной канализационной системы.
Традиционные методы изучения микроорганизмов основаны на их культивировании в лабораторных условиях и последующем секвенировании выделенных культур. Однако этот подход ограничен, поскольку значительная часть бактерий в окружающей среде не может быть культивирована традиционными методами. Следовательно геномные последовательности многих таксонов не обнаруживаются и не представлены в базах данных эталонных последовательностей. Метагеномные подходы, основанные на референсах, в значительной степени опираются на имеющиеся референсы, что создает проблемы при анализе образцов, содержащих высокую долю неохарактеризованных таксонов.
Тем не менее, при достаточной глубине метагеномного секвенирования микробные геномы могут быть реконструированы непосредственно из метагеномов. Считывания, полученные в результате дробного секвенирования, могут быть собраны в более длинные контиги, которые можно сгруппировать в геномы, используя общие характеристики, такие как совместная встречаемость и частота коротких к-меров (короткие последовательности фиксированной длины - прим.пер.). Этот процесс, известный как биннинг генома, позволяет получить черновые или полные геномы, открывая ранее неизвестные виды микроорганизмов без необходимости использования методов культивирования. Без культивирования мы можем распределить виды по группам с идентичностью геномов 95%+.
Также важно учитывать, что все метагеномные данные о численности являются композиционными по своей природе, поскольку они отражают относительные пропорции фрагментов ДНК различных таксонов, а не их абсолютное количество. Эта особенность обусловлена тем, что современное дробное секвенирование работает с фиксированной производительностью, то есть обнаруженное обилие одного таксона зависит от коллективного обилия всех других таксонов и ограничивается им.
В данном исследовании мы сообщаем о наших усилиях по получению и количественной оценке геномов тысяч видов бактерий из сточных вод и соотносим полученные результаты с целью надзора за AMR. Чтобы улучшить эпиднадзор, мы попытались восстановить геномы сточных вод и разработать рабочий процесс количественной оценки и корреляции этих геномов и AMR с течением времени. Мы использовали длительный отбор проб сточных вод на семи очистных сооружениях из пяти крупных европейских городов, чтобы изучить полезность секвенирования этих образцов на уровне популяции.
Используя методы сборки метагеномов, мы восстановили 2332 собранных генома (MAGs) прокариотических видов, 1334 из которых ранее не были описаны. Эти геномы составляют ~69% секвенированной ДНК и дают представление о динамике развития микроорганизмов в сточных водах. В Роттердаме (Нидерланды) и Копенгагене (Дания) наблюдаются сильные сезонные сдвиги микробных сообществ, а в Болонье, Риме (Италия) и Будапеште (Венгрия) периодически наблюдается рост сообществ с преобладанием Pseudomonas, на долю которых приходится до ~95% ДНК образцов. Сезонные сдвиги и цветение представляют собой основную проблему для эффективного мониторинга сточных вод.
Мы обнаружили, что бактерии известного общего происхождения, например микробиота кишечника человека, образуют сообщества, что дает возможность определить источник новых видов и их ARG с помощью анализа сетевых сообществ. Это может значительно улучшить отслеживание AMR в городских условиях.
