Микробы, гены и почва: истории о патогенах прошлого
Вооружившись секвенаторами ДНК и мощными вычислительными системами, палеогенетики обращают свой взор на древние микроорганизмы, чтобы воздать бактериям должное за их участие в истории человечества.
Первая документально подтвержденная эпидемия сифилиса вспыхнула во французской армии во время ее вторжения в Неаполь в 1495 году. Оттуда эта венерическая болезнь быстро распространилась по Европе, но откуда она взялась? Время вспышки заболевания, а также другие факты позволили некоторым исследователям выдвинуть гипотезу о том, что экипаж Христофора Колумба привез бактерии, вызывающие это заболевание, - Treponema pallidum - из Америки после трансатлантических путешествий. Однако новые данные о древних микробных геномах заставляют усомниться в этой теории, считает Кертту Маяндер, археогенетик из Базельского университета (Швейцария).
При исследовании костей и зубов людей, похороненных в Европе во время и в течение нескольких столетий после плавания Колумба, Маяндер обнаружил два случая сифилиса, один случай родственного заболевания под названием "фрамбезия" и одну инфекцию, вызванную родственной бактерией, которая в настоящее время уже не встречается. Все эти заболевания были вызваны подвидами T. pallidum, а генетическое разнообразие, наблюдавшееся в инфицированных скелетах, найденных в Нидерландах, Финляндии и Эстонии, т.е. далеко от места причаливания Колумба, позволяет предположить, что эти микроорганизмы могли циркулировать в Европе задолго до 1490-х годов. Что бы еще ни делали Колумб и его экипажи, в занесении сифилиса в Старый Свет они вряд ли виновны.
Помимо исторического любопытства, жизнь микробов, сосуществующих с людьми, тесно переплетается с историей человечества, и это важно понять. "Продолжающаяся пандемия наглядно показала, что нам действительно необходимо понять ключевые вещи, связанные с возникновением и эволюцией инфекционных заболеваний, - утверждает Себастьян Дюшен, специалист по вычислительной биологии, занимающийся вопросами эволюции инфекционных заболеваний в Институте Доэрти в Мельбурне (Австралия).
По словам Кирстен Бос, специалиста по древним ДНК из Института эволюционной антропологии Макса Планка в Лейпциге (Германия), еще пару десятилетий назад извлечение пригодных для секвенирования фрагментов ДНК из скелетов многовековой давности казалось невозможным. Но секвенирование нового поколения идеально подходит для работы с короткими фрагментами, которые можно извлечь из древних микробных геномов, некоторые из которых имеют длину всего 30 пар оснований.
Эти методы позволили исследователям определять возбудителей заболеваний, которые были лишь в общих чертах описаны в исторических документах, и могут быть использованы для отслеживания человеческой деятельности и миграций на основе сопровождавших их микробов. Бос и другие исследователи подтвердили, что возбудитель чумы, Yersinia pestis, действительно являлась причиной второй пандемии чумы в XIV-XVIII веках, чумы Юстиниана, начавшейся в VI веке, и даже эпидемий, возникших до появления письменных свидетельств о чуме. Древние геномы даже позволяют предположить, что бактерия заражала людей до того, как приобрела способность заражать блох, являющихся современными переносчиками. Исследователи секвенировали ДНК микроорганизмов, обитавших в полости рта, за десятки тысяч лет до нашей эры и, возможно, смогут продвинуться еще дальше, получив подходящие образцы.
Работа требует тщательной подготовки образцов и мощных вычислительных технологий, а также умения отличать настоящие древние геномы от современных контаминаций. Кроме того, возникают этические вопросы, когда ученые - в основном из богатых стран Северного полушария - обнародуют интимные биологические подробности о древних народах в других частях света. Тем временем исследователи продолжают расширять технические границы, углубляясь в переплетенную историю человека и микробов. "Все эти патогены имеют свою собственную историю", - говорит Пуджа Свали, генетик из Института Фрэнсиса Крика в Лондоне. "Мы все просто пытаемся собрать ее воедино".
Поиск фрагментов ДНК
Изучение истории древних микробов часто начинается со скелетных останков. Некоторые заболевания, в том числе сифилис и проказа, оставляют свой след в костях, поэтому ученые, интересующиеся этими патогенами, могут извлечь ДНК из образца размером с горошину. В иных случаях стоит обратить внимание на внутреннюю полость зубов: кровоток напрямую поступает в пульпу зуба, которая, как правило, хорошо защищена на протяжении столетий. Ученые, интересующиеся микробиомом полости рта, могут начать с обломка зубного камня, а сохранившиеся фекалии, хотя и редко, могут дать представление о микробиоме кишечника. По словам Кристины Уориннер, биомолекулярного археолога из Гарвардского университета в Кембридже, даже старые контейнеры для еды могут содержать микробы, позволяющие получить сведения о рационе питания.
Независимо от источника, древние образцы подвергаются большим испытаниям по сравнению с их аналогами в современной микробной геномике. Кости и зубы часто лежат в почве, склепах или музеях на протяжении многих поколений. Вода и тепло повреждают ДНК, поэтому чем холоднее и суше условия, тем лучше. Но даже в таких условиях микробы из окружающей среды могут со временем проникать в кости. Современные микроорганизмы могут попасть в кости и при работе археологов с останками или при их хранении в музеях.
Зубной камень может сохранять микробную ДНК в течение тысячелетий. Фото: Werner Siemens Foundation, Felix Wey
Чтобы избежать дальнейшей контаминации при подготовке образцов, исследователи древней ДНК работают в суперсовременных чистых помещениях и используют максимально чистые реагенты. Их лаборатории во многом напоминают те, которые используются для изучения возбудителей особо опасных инфекций, но защищаются не ученые, а образцы. "Мы шутим, что больше занимаемся уборкой, чем наукой", - говорит Лаура Вейрих, палеомикробиолог из Университета штата Пенсильвания.
Поиск совпадений
Секвенирование всего содержимого образца позволяет получить метагеном: фрагменты генетического кода множества организмов, включая человека-хозяина, интересующие микроорганизмы и микробные контаминанты. По словам Марии Спиру, специалиста по археогеномике из Тюбингенского университета (Германия), возможно, 1% будет составлять искомая микробная ДНК, а если ученые охотятся за конкретным патогеном, то и того меньше. Но как только исследователи идентифицируют образец, зараженный определенной бактерией, они могут использовать небольшие фрагменты генома этого организма в качестве приманки, чтобы выловить больше его генетического материала.
Палеомикробные генетики имеют дело с раритетами: иногда материала достаточно лишь для однократного секвенирования генома, - рассказывает Мериам Геллиль, палеогенетик из Венского университета. Это создает большие возможности для ошибок, и именно поэтому современное секвенирование целых геномов предполагает покрытие в 30 и более раз. При таком неравномерном охвате древних геномов "мы должны быть очень осторожны в интерпретации наших результатов", - говорит Дюшен.
Получив в свое распоряжение геномы, исследователи могут попытаться сопоставить их с геномами известных микробов. Один из популярных подходов предполагает использование программы MALT, но из-за больших затрат времени на вычисления многие члены сообщества переходят на более быстрые алгоритмы, такие как Kraken. Эта программа разбивает геномы и образцы на небольшие сегменты длины k (так называемые k-меры, длиной около 30 оснований) и ищет совпадения между ними. И MALT, и Kraken предполагают, что виды, входящие в состав древнего образца, представлены в современных геномных библиотеках, но это большое допущение: по одной из оценок, секвенировано лишь около 2% геномов бактерий и других прокариот.
Альтернативный вариант - пропустить этап совмещения и собрать фрагменты в геном с нуля. Это требует глубокого охвата секвенированием, но, по словам Уориннер, "позволяет найти виды, которые еще не были открыты, и найти гены, которые еще не были описаны". Например, в начале этого года Уориннер и ее коллеги сообщили, что им удалось реконструировать геномы 459 бактерий из зубного камня неандертальцев и Homo sapiens, живших 100 тыс. лет назад.
Подобный анализ требует осторожности и опыта. Например, легко спутать Mycobacterium tuberculosis с одним из ее многочисленных близких (и безвредных) родственников, обитающих в почве, в которой часто находят кости. Одним из ключевых признаков достоверности является то, что древние геномы должны быть сильно повреждены, в то время как геномы современных контаминантов обычно выглядят странно нетронутыми. Это объясняется тем, что ДНК медленно разрушается в течение столетий, и отдельные нити свободно свисают с обоих концов фрагмента. Часто аминные группы могут быть потеряны с голых цитозиновых оснований, и цитозин превращается в урацил, который обычно не встречается в ДНК. В данных секвенирования урацил будет отображаться как тимин, то есть соответствующее основание ДНК, на обоих концах фрагментов. Компьютерный метод под названием mapDamage позволяет отследить эти закономерности.
Специалисты по древним геномам создали сообщество, которое готово помочь тем, кто не обладает такими знаниями. Они назвали его SPAAM: Standards, Precautions, and Advances in Ancient Metagenomics. Например, говорит Свали, в рабочем пространстве SPAAM в Slack есть канал "Никаких глупых вопросов" для тех, кто хочет учиться. Другая инициатива SPAAM, получившая название AncientMetagenomeDir, каталогизирует опубликованные данные по древним геномам со всеми соответствующими метками, такими как номера присоединения к базе данных и даты.
Расширяя границы
Работа с древними ДНК подразумевает сотрудничество не только с другими молекулярными биологами, но и с музейными хранителями, историками и даже современными родственниками изучаемых людей. Такое сотрудничество может значительно обогатить исследования, считает Спиру. Например, при изучении Y. pestis на двух кладбищах XIV века в Кыргызстане Спиру сотрудничал с Филипом Славиным из Университета Стирлинга (Великобритания). Славин изучал надгробные эпитафии, дневники раскопок XIX века и торговые связи жителей с другими регионами Евразии - детали, которые добавили важный контекст к генетике, когда работа была опубликована в журнале Nature в 2021 году. "Дело не только в изучении геномов этих патогенов или геномов этих людей", - говорит Спиру. "Речь идет о том, чтобы дать полную картину".
Эта полная картина включает в себя реальных людей, которые когда-то жили, работали, любили - и оставили потомков. Ученые иногда забывают об этом, стремясь опубликовать свои результаты, предупреждает Мария Авила-Аркос, палеогенетик из Национального автономного университета Мексики в Хурикилье. Авила-Аркос обеспокоена тем, что многие лаборатории, выполняющие интенсивную и дорогостоящую работу по анализу древних ДНК, сконцентрированы в богатых странах. Но некоторые из них изучают образцы из менее развитых стран и получают выгоду от публикации исторических повествований. "Они как бы извлекают - я бы использовала это слово в некоторых случаях - древние образцы, являющиеся частью национального достояния, обрабатывают их в лабораторных условиях, чтобы получить сотни или тысячи древних геномов, и получают эти документы без какой-либо реальной пользы для местных учреждений, исследователей или сообществ, откуда были взяты эти образцы", - утверждает она.
Авила-Аркос считает, что вместо того, чтобы самим собирать образцы, ученым следует сотрудничать с местными исследователями, которые, вероятно, лучше понимают культуру данного региона. Она также советует исследователям быть осторожными в формулировках своих выводов, чтобы избежать стигматизации определенных групп. Например, ее группа изучала возбудителей эпидемий, которые возникали на территории современной Мексики в колониальную эпоху. Обнаруженные ею геномы были связаны со штаммами вируса гепатита В и парвовируса В, которые, как установила команда, вероятно, были завезены в страну из Африки в результате трансатлантической работорговли. В своей работе она старалась подчеркнуть, что связь существует именно с торговлей, а не с тем, что в эпидемиях следует винить людей, попавших в рабство.
По словам Вейрих, в исследованиях с более поздними останками у родственников или потомков могут возникнуть сомнения по поводу того, какие результаты следует публиковать. Например, если образцы содержат свидетельства заболевания, передающегося половым путем, то потомки могут опасаться, что обнародование этого факта приведет к стигматизации их семьи. По ее словам, важно проводить консультации с местными жителями и их представителями до сбора образцов и после получения результатов. Например, в рамках проекта по анализу зубного камня во Французской Полинезии Вейрих сотрудничает с такими организациями, как Департамент культуры и наследия и Музей Таити, чтобы определить общие цели и риски, узнать, как местные жители хотели бы, чтобы результаты были опубликованы, и поделиться первыми результатами.
Еще один элемент этической практики - рассмотреть возможность публикации исходных данных, - говорит Уориннер. Это важно, поскольку позволяет ученым получить максимум информации из каждого кусочка зуба или кости, проанализированного в лаборатории, и не допустить потери древнего материала. Например, у ученых, интересующихся древними геномами человека, может возникнуть соблазн отбросить данные о генах микроорганизмов, но они могут быть полезны другим исследователям. Например, данные о последовательностях, полученные при изучении человеческих популяций бронзового века, впоследствии были использованы для идентификации семи случаев чумы, что позволило расширить известные связи между людьми и Y. pestis по крайней мере до периода 5 тыс. лет тому назад.
По мере того как ученые будут расширять технические возможности, этические соображения будут становиться все более важными. Так, например, в настоящее время исследователи успешно работают с ДНК-вирусами, такими как гепатит В и оспа, которые имеют гораздо меньшие геномы, чем бактерии. Вирусы с хрупкими РНК-геномами еще более сложны, но ученые уже извлекли РНК из сохранившихся образцов легких вирусов гриппа и кори, причем более чем столетней давности.
Исследователи даже начинают использовать древние последовательности для воскрешения древних белков. Например, группа Уориннер использовала секвенированные гены палеолитических микроорганизмов для создания двух белков, которые генерировали ранее неизвестные метаболиты, названные ими палеофуранами. По предположению авторов, эти молекулы могли участвовать в регулировании бактериального фотосинтеза.
По словам Бос, каждый раз, когда ей кажется, что исследователи древних ДНК проникли в прошлое настолько глубоко, насколько это позволяет молекулярная сохранность, новая работа доказывает, что она ошибается. "Я не хочу ставить жестких ограничений на то, как далеко в прошлое мы можем зайти", - говорит она. "Мы постоянно расширяем границы того, что нам доступно в плане древних молекул, сохранившихся на протяжении долгого времени".
И каждая крупица информации помогает. Например, Маяндер стремится узнать больше о распространении сифилиса и связанных с ним патогенов в эпоху раннего нового времени. Врачи, начиная с 1700-х годов, характеризовали сифилис как болезнь "греховных" городских центров - так ли это? Распространение инфекции от матери к ребенку во время беременности также может дать представление о структуре семьи и положении женщин в прошлом, считает Маяндер. Хотя в настоящее время доступны лишь несколько исторических геномов возбудителя сифилиса, большее количество последовательностей может пролить свет на то, как патоген перемещался и влиял на жизнь людей.
В конце концов, микробы не существуют в одиночку. Их история часто является историей человека и ученые открывают ее по одному геному за раз.
