В данном обзоре рассматриваются 12 оригинальных научных статей и 2 обзора c целью представить обновленный взгляд на современные инновации в молекулярной диагностике и вызовы в борьбе с клиническими патогенами.
Распространенность инфекционных заболеваний высока и часто вызывает критические заболевания, которые серьезно угрожают жизни и здоровью человека. Диагностика и лечение зависят от методов этиологической детекции. Поэтому для своевременного, точного и всестороннего выявления патогенов необходима технология этиологической диагностики. Традиционные методы этиологической диагностики инфекций в основном включают морфологическую идентификацию, культуру микроорганизмов, микроскопическое исследование мазка, обнаружение антигенов и антител, обнаружение нуклеиновых кислот и т.д. Однако эти методы имеют множество ограничений, таких как длительное время идентификации, низкая чувствительность и узкий спектр обнаружения патогенов, особенно при инфекциях, вызванных редкими или новыми патогенами. Традиционные методы обнаружения не могут эффективно решить эти проблемы.
Поэтому существует острая необходимость в разработке ряда более мощных инструментов для обнаружения патогенов. Метагеномное секвенирование нового поколения (mNGS) - это мощный метод обнаружения патогенов, который потенциально может диагностировать нуклеиновые кислоты (ДНК и РНК) всех инфекционных заболеваний, включая бактерии, грибы, вирусы и паразитов, в одном тесте. Метод признан прорывным методом обнаружения патогенов, особенно для редких и сложных инфекционных заболеваний.
Specific High Sensitivity Enzymatic Reporter UnLOCKing (SHERLOCK) - это платформа молекулярной диагностики, основанная на использовании энзимологии CRISPR-Cas для специфического распознавания нужных последовательностей ДНК или РНК. Этот метод был использован для обнаружения таких вирусов, как Зика, денге и вирус африканской чумы свиней. Хотя mNGS и SHERLOCK сыграли активную роль в диагностике клинических инфекций, они все еще сталкиваются со многими ограничениями и проблемами при клиническом применении (например, контроль качества и стандартизация, дифференциация болезнетворных возбудителей от колонизирующих микроорганизмов, стабильность, простота и разнообразие мишеней).
В свете этих проблем появились новые исследовательские стратегии, которые расширяют возможности традиционных методов обнаружения патогенов. Этот обзор исследований включает, но не ограничивается статьями о:
(i) развитии методологии диагностики патогенов,
(ii) применении секвенирования в диагностике клинических инфекций,
(iii) развитии баз данных и процедур анализа для клинического применения метагеномики,
(iv) идентификации патогенов на основе CRISPR-Cas и
(v) обнаружении биомаркеров-кандидатов для диагностики инфекций.
В статье Lin Z. et al. сообщается о разработке визуального метода dRAA-CRISPR/Cas12a для выявления экспрессии вирулентных генов aerA и/или hlyA Aeromonas hydrophila. A. hydrophila является вновь появляющимся патогеном аквакультуры и патогеном, передающимся через воду/пищу человеку. Данный метод является быстрым и высокочувствительным. Результаты экспрессии генов могут быть прочитаны с помощью источника ультрафиолетового излучения. Авторы показали перспективность этого многообещающего метода для ранней диагностики инфекции A. hydrophila и обнаружения данного патогена на местах, особенно в районах с ограниченными ресурсами в пищевой промышленности и аквакультуре. В другом более раннем исследовании Wang et al. использовали аналогичный метод для точной идентификации и обнаружения Staphylococcus aureus в клинических образцах.
Ummarino et al. описывают новый метод диагностики Enterobius vermicularis в образцах кала на основе ПЦР, специально разработанного для клинического применения. Это первый случай использования такого метода для обнаружения этих нематод в образцах кала. Преимущества этого метода могут помочь в идентификации и молекулярной характеристике видов паразитов. Однако паразитологические методы и копрологический анализ (особенно яиц) в кале остаются золотым стандартом для такого обнаружения.
Chen W. et al. провели обзор актуальных знаний о современных молекулярных методах диагностики везикулярных заболеваний свиней, таких как вирус ящура (FMDV), SenecaVirus A (SVA) и Swine Vesicular Disease Virus (SVDV). Все эти вирусы являются представителями семейства Picornaviridae, которые могут вызывать везикулярные поражения в тканях ротовой полости, носа, ног, кожи и слизистой оболочки животных. RT-PCR и RT-PCR в реальном времени по-прежнему являются самыми надежными и золотыми стандартами для выявления вирусов, включая FMDV, SVA и SVDV. Авторы иллюстрируют новые методы молекулярной диагностики везикулярных инфекций. К ним относятся петлевая изотермическая амплификация (LAMP), рекомбиназная полимеразная амплификация (RPA) Luminex и технология CRISPR-Cas. Технология Luminex была разработана для дифференциальной диагностики FMDV, SVDV и других возбудителей везикулярных инфекций. Кроме того, флуоресцентный анализ Luminex на основе ПЦР подходит для генотипирования вируса папилломы человека (ВПЧ). Этот анализ можно использовать для получения важной клинической информации для раннего выявления ВПЧ.
Havasi et al. рассмотрели сходства и различия в диагностике гриппа А, гриппа В и SARS-CoV-2. Они обсудили клиническую картину гриппа и SARS-CoV-2 и методы, доступные для диагностики. Кроме того, они обобщили имеющиеся данные о мультиплексном диагностическом анализе обеих вирусных инфекций.
Lin Y. et al. разработали быстрый метод адаптивного секвенирования с использованием нанопор (RPNAS) на основе ПЦР для обогащения вирусного генома непосредственно из респираторных образцов. Этот же метод был успешно применен для обогащения SARS-CoV-2. Эти результаты обещают улучшить чувствительность и скорость клинического выявления вирусов и геномного надзора.
Цирковирус свиней (PCV) типа 2 был идентифицирован как возбудитель синдрома мультисистемного истощения (PMWS), экономически важного многофакторного заболевания в свиноводстве во всем мире. Li et al. разработали метод двойной вложенной ПЦР для одновременного мониторинга PCV типов 2 и 3. Этот метод представляет собой эффективный инструмент для молекулярно-эпидемиологических исследований и обнаружения PCV в образцах крови.
Zhang et al. решили сосредоточить свою работу на молекулярных характеристиках, восприимчивости и распространенности инфекции Cryptococcus spp. для понимания эпидемиологии этого заболевания в одной из провинций Китая. Они собрали большое количество данных по 180 штаммам Cryptococcus, используя метод полногеномного секвенирования (WGS). Эти данные заложат хорошую основу для последующей разработки молекулярных методов обнаружения Cryptococcus spp.
Chlamydia trachomatis - один из самых распространенных патогенов, вызывающих инфекции, передающиеся половым путем. В своем исследовании Zhao et al. использовали высокопроизводительное секвенирование следующего поколения (NGHTS) для определения генотипов C. trachomatis, особенно инфекций со смешанным генотипом, и их связи с клиническими проявлениями. Результаты показали, что NGHTS подходит для выявления инфекций C. trachomatis смешанного генотипа. В другом исследовании Chen X. et al. интегрировали биосенсоры на основе наночастиц с LAMP для быстрой и визуальной идентификации C. trachomatis, что может обеспечить удобный инструмент для point-of-care скрининга хламидийной инфекции.
Haemophilus influenzae - распространенный человеческий патоген, вызывающий целый ряд инфекционных заболеваний у детей и взрослых. Cheng et al. сообщили о клиническом применении метода LAMP для быстрого обнаружения H. influenzae. Этот анализ обеспечивает быстрое, точное и чувствительное обнаружение, что делает его перспективной стратегией скрининга в условиях клинической лаборатории. В другой работе Slotved et al. оценили использование полногеномного секвенирования (WGS) в национальном эпиднадзоре и характеристике клинических изолятов H. influenza в Дании. Их результаты показали 100% совпадение между фенотипическими методами серотипирования и подходами на основе WGS.
Кожный лейшманиоз - это заболевание, вызываемое простейшими паразитами рода Leishmania и являющееся серьезной проблемой здравоохранения во многих частях мира. Dueñas et al. разработали молекулярные инструменты на основе CRISPR для диагностики инфекций Leishmania на уровне рода и подродов L. (Viannia). Gao et al. сообщили о двух случаях висцерального лейшманиоза в Китае, диагностированных с помощью mNGS. Их сообщения свидетельствуют о том, что обнаружение mNGS полезно для диагностики и лечения инфекционных заболеваний с неизвестными причинами.
Данный обзор включил несколько превосходных исследований, обобщающих последние достижения в области технологии молекулярного выявления патогенных микроорганизмов и аккумулирующих большое количество геномных данных патогенов. Этот обзор поможет интеграции и использованию технологии молекулярного обнаружения и геномных данных патогенов в будущем и в создании более простых, быстрых и точных методы обнаружения возбудителей инфекций.
Создание системы, объединяющей геномные последовательности патогенов из многочисленных осуществляемых эпиднадзоров, таких как пищевые и внутрибольничные, даст возможность проводить автоматизированный анализ в режиме реального времени. Это позволит быстро выявлять геномные последовательности патогенов, потенциальные цепочки передачи и предупреждать о вспышках заболеваний. Тем не менее, при разработке новых методов обнаружения следует учитывать экономическую составляющую стран с низким и средним уровнем дохода для обеспечения равенства.
