Микробиологический анализ неочищенных и очищенных сточных вод стал актуальной темой в последние годы в связи с возникающей озабоченностью эпидемиологическим отслеживанием заболеваний/патогенов и безопасностью сброса и повторного использования сточных вод.
Мониторинг сточных вод уже давно и успешно применяется для отслеживания химических загрязнителей, распространения лекарственных препаратов в сообществах и генов резистентности к антибиотикам (ARGs). В последние годы обнаружение вирусов в образцах сточных вод с помощью молекулярного анализа позволило осуществлять эпиднадзор за заболеваниями, как, например, за полиовирусом во время глобальной программы искоренения, за вновь появляющимися зоонозными патогенами, такими как вирус гепатита Е, энтеральные вирусы человека и совсем недавно коронавирус 2 тяжелого острого респираторного синдрома (SARS-CoV-2).
Энтеральные вирусы человека являются возбудителями вирусных гастроэнтеритов, гепатитов и других заболеваний, которые передаются преимущественно фекально-оральным путем. Распространение вирусов в основном связано с контактами между людьми и употреблением зараженной пищи и воды, поскольку энтеровирусы выделяются в огромных концентрациях - до 1013 частиц на грамм - как симптоматическими, так и бессимптомными людьми. Ротавирус группы А (RV), норовирус геногрупп I (GI) и II (GII), вирус гепатита А (HAV) и астровирус человека (HAstV) являются основными возбудителями вспышек вирусных гастроэнтеритов и гепатитов, связанных с водой, во всем мире (Bosch et al., 2008).
Энтеральные вирусы человека демонстрируют повышенную устойчивость к обеззараживающим процедурам, обычно применяемым на очистных сооружениях (ОС), таким как хлорирование и ультрафиолетовое излучение. Следовательно, рекультивация на ОС обычно не достигает полного удаления вирусных частиц из сточных вод, и они часто обнаруживаются в анализах проб сточных вод.
В контексте обострившейся нехватки воды использование восстановленной воды для орошения, рекреационных или промышленных целей стало стратегией решения этой критической проблемы. С точки зрения общественного здравоохранения, мониторинг не только распространенности, но и инфекционности вирусных патогенов человека может позволить оценить адекватность существующих систем рекультивации воды. Для решения этой проблемы альтернативными стратегиями являются нацеливание на конкретные вирусные патогены человека или правильно выбранный индикатор.
Традиционно в клинической вирусологии для тестирования на вирусную инфекционность используются методы, основанные на культуре клеток, которые имеют значительные ограничения при применении в образцах окружающей среды из-за совместной контаминации несколькими видами вирусов, отсутствия приемлемых клеточных линий для некоторых вирусов и цитотоксического эффекта сточных вод в культуре клеток.
В последние годы достигнут огромный прогресс в обнаружении энтеральных вирусов в образцах воды с помощью методов полимеразной цепной реакции (qPCR) в режиме реального времени. Несмотря на это, молекулярные анализы не позволяют различать вирусы с инфекционной способностью, инактивированные вирусы и свободный геном. Чтобы преодолеть это ограничение, маркеры жизнеспособности и анализы связывания были соединены с qPCR детекцией для оценки целостности вирусного капсида в качестве оценки вирусной инфекционности также в образцах воды. Следует отметить, что такой подход совсем недавно был применен для выявления SARS-CoV-2 в сточных водах (Canh et al., 2021b; Cuevas-Ferrando et al., 2021).
Целостность капсида является сильным индикатором инфекционности вируса, поскольку вирионы с доступным геномом дают пониженные сигналы qPCR, улучшая молекулярную оценку вирионов. В качестве альтернативы фекальные индикаторные бактерии (ФИБ) традиционно используются для оценки фекального загрязнения вод окружающей среды, хотя данные эпиднадзора показали, что ФИБ не всегда коррелируют с энтеральными вирусами человека. Недавно такие вирусы, как crAssphage (фаг перекрестной сборки), вирус табачной мозаики (TMV) и вирус мягкой крапчатости перца (PMMoV), были предложены в качестве индикаторов фекального загрязнения и удаления вирусных патогенов человека при рекультивации сточных вод в ОС (Kitajima et al., 2014; García-Aljaro et al., 2017; Farkas et al., 2019, 2020; Symonds et al., 2019; Bivins et al., 2020a; Tandukar et al., 2020; Wu et al., 2020).
Таким образом, основной целью данного исследования было определение наличия инфекционных энтеральных вирусов человека в поступающих и сточных водах с помощью экспрессных молекулярных методов и, во-вторых, проверка гипотезы о том, будет ли crAssphage служить индикатором вирусной инфекционности.
С этой целью в течение 1 года мы отслеживали методом PMAxx-RT-qPCR появление интактных капсидных потенциально инфекционных РНК энтеральных вирусов (т.е. норовирусов GI и GII, HAV, RV и HAstV) и crAssphage в пробах сточных вод, собранных с четырех водоканалов региона Валенсия (Испания). Кроме того, образцы сточных и приточных вод выбранной станции очистки сточных вод были дополнительно проанализированы с помощью анализа RT-qPCR с захватом in situ (ISC-RT-qPCR) для оценки вирусной инфекционности в качестве альтернативы PMAxx-RT-qPCR. Наши результаты показали более низкую распространенность и концентрацию вирусов, оцененную с помощью ISC-RT-qPCR, чем PMAxx-RT-qPCR. Распространенность потенциально инфекционных энтеральных вирусов была оценена методом PMAxx-RT-qPCR как 88-94% в поступающих и 46-67% в сточных водах со средним титром от 4,77 до 5,89 и от 3,86 до 4,97 log10 GC/L, за исключением HAV, который был обнаружен спорадически.
Все образцы оказались положительными на crAssphage в концентрации от 7,41 до 9,99 log10 GC/L в притоке и от 4,56 до 6,96 log10 GC/L в сточных водах, демонстрируя более высокую среднюю концентрацию, чем целевые энтеральные вирусы. Данные, полученные с помощью PMAxx-RT-qPCR, показали, что crAssphage сильно коррелировал с норовирусом GII (ρ = 0,67, p < 0,05) и слабо с HAstV и RV (ρ = 0,25-0,30, p < 0,05) в пробах сточных вод. В сточных водах наблюдались слабые (ρ = 0,27-0,38, p < 0,05) или умеренные (ρ = 0,47-0,48, p < 0,05) корреляции между crAssphage и целевыми вирусами.
В целом, эти результаты подтверждают, что crAssphage является индикатором фекального загрязнения в сточных водах, но слабым маркером как вирусной распространенности, так и вирусной целостности/инфекционности. Несмотря на снижение вирусной нагрузки, которое было обнаружено в сточных водах по сравнению с поступающими сточными водами, оценки вирусной инфекционности, основанные на молекулярных методах определения жизнеспособности, могут представлять опасения для (повторного) использования очищенной воды.
