Мониторинг вирусных патогенов человека выявляет потенциальную опасность при очистке или повторном использовании сточных вод (аннотация)Мониторинг вирусных патогенов человека выявляет потенциальную опасность при очистке или повторном использовании сточных вод
Микробиологический анализ неочищенных и очищенных сточных вод стал актуальной темой в последние годы в связи с возникающей озабоченностью эпидемиологическим отслеживанием заболеваний/патогенов и безопасностью сброса и повторного использования сточных вод.
Мониторинг сточных вод уже давно и успешно применяется для отслеживания химических загрязнителей, распространения лекарственных препаратов в сообществах и генов резистентности к антибиотикам (ARGs). В последние годы обнаружение вирусов в образцах сточных вод с помощью молекулярного анализа позволило осуществлять эпиднадзор за заболеваниями, как, например, за полиовирусом во время глобальной программы искоренения, за вновь появляющимися зоонозными патогенами, такими как вирус гепатита Е, энтеральные вирусы человека и совсем недавно коронавирус 2 тяжелого острого респираторного синдрома (SARS-CoV-2).
Энтеральные вирусы человека являются возбудителями вирусных гастроэнтеритов, гепатитов и других заболеваний, которые передаются преимущественно фекально-оральным путем. Распространение вирусов в основном связано с контактами между людьми и употреблением зараженной пищи и воды, поскольку энтеровирусы выделяются в огромных концентрациях - до 1013 частиц на грамм - как симптоматическими, так и бессимптомными людьми. Ротавирус группы А (RV), норовирус геногрупп I (GI) и II (GII), вирус гепатита А (HAV) и астровирус человека (HAstV) являются основными возбудителями вспышек вирусных гастроэнтеритов и гепатитов, связанных с водой, во всем мире (Bosch et al., 2008).
Энтеральные вирусы человека демонстрируют повышенную устойчивость к обеззараживающим процедурам, обычно применяемым на очистных сооружениях (ОС), таким как хлорирование и ультрафиолетовое излучение. Следовательно, рекультивация на ОС обычно не достигает полного удаления вирусных частиц из сточных вод, и они часто обнаруживаются в анализах проб сточных вод.
В контексте обострившейся нехватки воды использование восстановленной воды для орошения, рекреационных или промышленных целей стало стратегией решения этой критической проблемы. С точки зрения общественного здравоохранения, мониторинг не только распространенности, но и инфекционности вирусных патогенов человека может позволить оценить адекватность существующих систем рекультивации воды. Для решения этой проблемы альтернативными стратегиями являются нацеливание на конкретные вирусные патогены человека или правильно выбранный индикатор.
Традиционно в клинической вирусологии для тестирования на вирусную инфекционность используются методы, основанные на культуре клеток, которые имеют значительные ограничения при применении в образцах окружающей среды из-за совместной контаминации несколькими видами вирусов, отсутствия приемлемых клеточных линий для некоторых вирусов и цитотоксического эффекта сточных вод в культуре клеток.
В последние годы достигнут огромный прогресс в обнаружении энтеральных вирусов в образцах воды с помощью методов полимеразной цепной реакции (qPCR) в режиме реального времени. Несмотря на это, молекулярные анализы не позволяют различать вирусы с инфекционной способностью, инактивированные вирусы и свободный геном. Чтобы преодолеть это ограничение, маркеры жизнеспособности и анализы связывания были соединены с qPCR детекцией для оценки целостности вирусного капсида в качестве оценки вирусной инфекционности также в образцах воды. Следует отметить, что такой подход совсем недавно был применен для выявления SARS-CoV-2 в сточных водах (Canh et al., 2021b; Cuevas-Ferrando et al., 2021).
Целостность капсида является сильным индикатором инфекционности вируса, поскольку вирионы с доступным геномом дают пониженные сигналы qPCR, улучшая молекулярную оценку вирионов. В качестве альтернативы фекальные индикаторные бактерии (ФИБ) традиционно используются для оценки фекального загрязнения вод окружающей среды, хотя данные эпиднадзора показали, что ФИБ не всегда коррелируют с энтеральными вирусами человека. Недавно такие вирусы, как crAssphage (фаг перекрестной сборки), вирус табачной мозаики (TMV) и вирус мягкой крапчатости перца (PMMoV), были предложены в качестве индикаторов фекального загрязнения и удаления вирусных патогенов человека при рекультивации сточных вод в ОС (Kitajima et al., 2014; García-Aljaro et al., 2017; Farkas et al., 2019, 2020; Symonds et al., 2019; Bivins et al., 2020a; Tandukar et al., 2020; Wu et al., 2020).
Таким образом, основной целью данного исследования было определение наличия инфекционных энтеральных вирусов человека в поступающих и сточных водах с помощью экспрессных молекулярных методов и, во-вторых, проверка гипотезы о том, будет ли crAssphage служить индикатором вирусной инфекционности.
С этой целью в течение 1 года мы отслеживали методом PMAxx-RT-qPCR появление интактных капсидных потенциально инфекционных РНК энтеральных вирусов (т.е. норовирусов GI и GII, HAV, RV и HAstV) и crAssphage в пробах сточных вод, собранных с четырех водоканалов региона Валенсия (Испания). Кроме того, образцы сточных и приточных вод выбранной станции очистки сточных вод были дополнительно проанализированы с помощью анализа RT-qPCR с захватом in situ (ISC-RT-qPCR) для оценки вирусной инфекционности в качестве альтернативы PMAxx-RT-qPCR. Наши результаты показали более низкую распространенность и концентрацию вирусов, оцененную с помощью ISC-RT-qPCR, чем PMAxx-RT-qPCR. Распространенность потенциально инфекционных энтеральных вирусов была оценена методом PMAxx-RT-qPCR как 88-94% в поступающих и 46-67% в сточных водах со средним титром от 4,77 до 5,89 и от 3,86 до 4,97 log10 GC/L, за исключением HAV, который был обнаружен спорадически.
Все образцы оказались положительными на crAssphage в концентрации от 7,41 до 9,99 log10 GC/L в притоке и от 4,56 до 6,96 log10 GC/L в сточных водах, демонстрируя более высокую среднюю концентрацию, чем целевые энтеральные вирусы. Данные, полученные с помощью PMAxx-RT-qPCR, показали, что crAssphage сильно коррелировал с норовирусом GII (ρ = 0,67, p < 0,05) и слабо с HAstV и RV (ρ = 0,25-0,30, p < 0,05) в пробах сточных вод. В сточных водах наблюдались слабые (ρ = 0,27-0,38, p < 0,05) или умеренные (ρ = 0,47-0,48, p < 0,05) корреляции между crAssphage и целевыми вирусами.
В целом, эти результаты подтверждают, что crAssphage является индикатором фекального загрязнения в сточных водах, но слабым маркером как вирусной распространенности, так и вирусной целостности/инфекционности. Несмотря на снижение вирусной нагрузки, которое было обнаружено в сточных водах по сравнению с поступающими сточными водами, оценки вирусной инфекционности, основанные на молекулярных методах определения жизнеспособности, могут представлять опасения для (повторного) использования очищенной воды.
