Исследователи перепрограммировали бактериальные мостиковые рекомбиназы для редактирования больших участков генома в клетках млекопитающих, открыв новый многообещающий инструмент для точного редактирования генов.
Появление CRISPR-Cas изменило редактирование генома, но оно остается ограниченным из-за проблем с доставкой и побочных эффектов, что привело к разработке усовершенствованных инструментов, таких как праймированное редактирование генома и редактирование оснований. Тем не менее, многие генетические заболевания, такие как муковисцидоз и пигментный ретинит, происходят из—за различных мутаций в одном гене и требуют введения больших фрагментов ДНК, специфичных для конкретного участка, что недоступно современным методам.
Чтобы устранить этот пробел, ученые из Цюрихского университета исследовали, могут ли рекомбиназы, управляемые мостиковой РНК, которые могут вызывать точную перестройку ДНК in vitro у бактерий, быть внедрены в клетки млекопитающих. В недавнем исследовании продемонстрировано, что мостиковая рекомбиназа ISCro4 работает в клеточных линиях человека и выполняет корректирующее редактирование генома в клинически значимых геномных локусах. Эти результаты подчеркивают потенциал мостиковых рекомбиназ в качестве молекулярной платформы для разработки следующего поколения инструментов геномной инженерии.
Рекомбиназы, управляемые мостиковой РНК, происходят из семейства IS110 - бактериальных элементов, способных переносить последовательность встраивания. Эти мобильные элементы могут управлять крупными геномными перестройками; они экспрессируют некодирующую РНК — мостиковую РНК, которая содержит две связывающие петли, способные распознавать ДНК—мишень и ДНК-донор. Эти петли могут быть сконструированы таким образом, чтобы перепрограммировать рекомбиназу IS621 для инвертирования, удаления или вставки больших последовательностей ДНК в определенные участки.
Исследователи впервые трансфицировали клеточную линию эмбриональной почки человека (HEK293T) с помощью IS621; однако, используя проточную цитометрию, они обнаружили, что эти клетки слабо экспрессируют рекомбиназу IS621. Они оценили другие мостиковые рекомбиназы семейства IS110 и обнаружили, что ISCro4, ортолог IS621, обладает высокой активностью рекомбинации, управляемой РНК, в клетках млекопитающих. Он эффективно удалял фрагменты размером с ген из плазмид в клетках HEK293T.
Чтобы понять причину наблюдаемых различий в эффективности, исследователи сосредоточились на структурных изменениях, возникающих в ходе этого процесса внутри комплекса. Они идентифицировали 39 остатков, которые различались между мостиковыми рекомбиназами. Из них в ISCro4 было больше серинов, которые, по-видимому, образовывали дополнительные водородные связи. Повышенное взаимодействие с этими нуклеиновыми кислотами, вероятно, способствовало повышению активности ISCro4, наряду с другими тонкими аминокислотными заменами в гидрофобном ядре и областях поверхности фермента, подверженных воздействию растворителя.
Затем исследователи проверили, может ли ISCro4 опосредовать инверсии и встраивания в HEK293T и K562 в клеточных линиях лимфобластов. Они обнаружили, что ISCro4 опосредует перестройки на уровне генов с различной эффективностью в двух типах клеток, достигая 75% инверсии в клетках HEK293T и 36% делеции в клетках K562. Полученные результаты свидетельствуют о том, что этот подход, вероятно, применим к клеткам млекопитающих.
Чтобы бороться с генетическими заболеваниями, требующими коррекции больших сегментов ДНК, исследователи протестировали ISCro4 на нескольких геномных локусах, связанных с заболеваниями. ISCro4 эффективно редактировал гены, связанные с муковисцидозом, серповидноклеточной анемией и бета-талассемией, что подчеркивает его потенциал для терапевтического применения. Хотя требуется дальнейшая оптимизация, исследователи полагают, что рекомбиназы ISCro4 в целом являются перспективной системой для решения проблем, связанных с технологиями, основанными на CRISPR.
