Уменьшенный механизм для нарезки ДНК может достичь большего количества тканей, чтобы бороться с большим количеством заболеваний.
После того как стратегия редактирования генов CRISPR появилась на свет, она столкнулась с серьезным ограничением: классическая система CRISPR слишком громоздка, чтобы проникать во многие ткани организма и делать свои нарезки. Недавно исследователи из компании, соучредителем которой является Дженнифер Дудна из Калифорнийского университета, получившая в 2020 году Нобелевскую премию за разработку CRISPR, сообщают о том, что, как они надеются, станет значительным шагом вперед. В препринте, опубликованном на днях, описывается «миниCRISPR», успешно доставленный в мышечные клетки мышей и обезьян, где он эффективно редактирует ген, связанный с нервно-мышечными расстройствами.
"Полученные результаты «действительно впечатляют", - считает Ник Бенгтссон, который изучает редактирование генов при нервно-мышечных заболеваниях в Университете Вашингтона и не принимал участия в работе. По его словам, мини-редактор генов, переносимый в клетки вирусом, обычно используемым в генной терапии, выглядит многообещающе в качестве своего рода «системы, готовой к использованию» при различных заболеваниях. Тем не менее, предупреждает он, остаются вопросы и препятствия, прежде чем стратегия будет опробована на людях.
CRISPR, которая изначально развивалась в бактериях как часть их иммунной системы, похожа на набор молекулярных ножниц, которые расщепляют ДНК в точных местах, позволяя вырезать проблемный участок гена с помощью нити РНК, которая направляет ее в нужное место. В декабре 2023 года американские регулирующие органы одобрили первую терапию на основе CRISPR, предназначенную для лечения серповидно-клеточной анемии. Эта терапия включает в себя извлечение стволовых клеток крови пациента и использование CRISPR для их исправления перед повторным введением в организм.
В настоящее время проводятся клинические испытания препаратов, которые доставляют механизм редактирования CRISPR непосредственно в кровоток, где он успешно редактирует гены в клетках печени. Но этот подход, при котором белки CRISPR упаковываются в жировые частицы, пока не работает в других тканях, поскольку до них доходит мало липидов. Вместо этого исследователи хотели бы переправить ДНК, кодирующую CRISPR, с помощью хорошо изученного адено-ассоциированного вируса, или AAV, который часто используется для доставки генной терапии. Однако сделать это непросто, в том числе потому, что компоненты CRISPR очень громоздки - в частности, фермент Cas9, разрезающий ДНК, обычно включает более 1300 аминокислот. Это слишком много ДНК, чтобы втиснуть ее в один AAV, поэтому исследователи пытаются доставить CRISPR и его направляющую РНК с помощью двух или более AAV. Но пока это не очень хорошо работает.
Несколько исследовательских групп работают над созданием миниатюрных систем CRISPR, которые все еще эффективны в редактировании, но могут быть упакованы всего в один вектор AAV. Среди них - сотрудники компании Mammoth Biosciences, которые возможно добились успеха. Они начали с изучения данных о генетических последовательностях всевозможных разновидностей CRISPR, которые встречаются в микробах, подвергли 176 кандидатов «шквалу тестов» и нашли «ту самую иголку в стоге сена», - рассказывает Лукас Харрингтон, главный научный сотрудник и соучредитель компании, бывший студент Дудны. Они назвали эту систему NanoCas; она состоит из 425 аминокислот, что составляет примерно одну треть длины Cas9. Харрингтон и его коллеги сконструировали NanoCas таким образом, чтобы он мог эффективно разрезать ДНК млекопитающих.
Такое уменьшение позволило уместить ДНК для системы редактирования в одном векторе AAV. Группа показала, что NanoCas может редактировать ДНК в различных клетках млекопитающих в лабораторных условиях, а затем перешла на мышей. Когда они использовали ее для отключения гена холестерина PCSK9 в печени, NanoCas успешно отредактировала около 60% клеток, что по эффективности не уступает Cas9. Затем они обратились к более сложной мишени для традиционного CRISPR: к мышцам. Они проверили, может ли NanoCas воздействовать на ген в мышечных клетках под названием дистрофин, который кодирует ключевой строительный белок. У людей с мышечной дистрофией Дюшенна - разрушительным заболеванием, приводящим к истощению мышц, которое обычно проявляется в раннем детстве, - в этом гене происходит мутация, и они не могут производить функциональный белок в достаточном количестве.
У мышей с человеческой версией мутировавшего гена дистрофина стратегия NanoCas работала хорошо, отредактировав от 10 до 40% клеток в различных типах мышц, включая сердечную и икроножную. (Эти модифицированные мыши не болеют, как люди с мутацией, поэтому исследователи не смогли оценить потенциальное влияние на симптомы болезни Дюшенна). И наконец, большое испытание было проведено на трех здоровых обезьянах макаках. Исследователи ввели в кровь животных AAV, несущий ДНК для CRISPR-содержащего вирусного вектора и его направляющую РНК. Они следили за функцией печени, поскольку ее повреждение может быть риском при терапии AAV; оказалось, что этот показатель и другие показатели здоровья остаются в пределах нормы. В зависимости от типа мышц, NanoCas отредактировал ген дистрофина в 30% клеток скелетных мышц обезьян; в сердечной мышце этот показатель был несколько ниже - около 15%. Эти уровни
«безусловно, находятся в диапазоне, который может быть клинически значимым»,
- считает Теренс Флотт, генный терапевт и декан Медицинской школы Массачусетского университета. Однако он и другие специалисты отмечают, что все еще только начинается. Пока нет информации о том, может ли эта стратегия помочь больному животному выздороветь. AAV также сопряжен с рисками, включая иммунные реакции и потенциальные «нецелевые» эффекты, когда здоровая ДНК оказывается затронутой случайно. «Предварительные данные обнадеживают, но они „ограничены“, - замечает Марк Кей, генный терапевт из Стэнфордского университета. Тем не менее, его радует то, как легко этот миниатюрный CRISPR помещается в вектор AAV, что открывает множество новых тканевых мишеней, в том числе для болезни Дюшенна - заболевания, которое остро нуждается в новых методах лечения, отмечает он.
Харрингтон признает наличие проблем, в том числе опасения по поводу AAV, но с надеждой смотрит в будущее. «Тот факт, что теперь мы можем очень эффективно редактировать с помощью одного AAV, делает доставку CRISPR в организм и редактирование ранее недоступных тканей не просто теоретическим“, - уверен он. Харрингтон сообщает, что компания Mammoth продолжит работу над болезнью Дюшенна и направит свою систему NanoCas на цели, имеющие отношение к другим заболеваниям мышц, а также к болезням мозга. "Мы действительно стараемся думать: что же мы можем сделать как можно быстрее?».
