Сепсис является причиной 20% всех смертей во всем мире и ранняя диагностика и выявление основных микробных патогенов необходимы для своевременной и адекватной антибиотикотерапии, которая имеет решающее значение для выживания при сепсисе.
Однако более чем в 30% случаев этиологический возбудитель не выявляется, что отражает ограничения современной культуральной микробиологической диагностики. Дополнительную сложность добавляет необходимость эффективно дифференцировать сепсис от неинфекционных системных заболеваний, которые часто выглядят клинически схожими на момент поступления в стационар.
В результате антибиотикотерапия часто остается эмпирической, а не направленной на конкретного возбудителя, а клинические решения принимаются на основе эпидемиологической информации, а не индивидуальных данных пациента. Аналогичным образом, врачи часто продолжают эмпирическое применение антимикробных препаратов, несмотря на отрицательные результаты микробиологического исследования, опасаясь навредить пациентам в случае ложноотрицательных результатов. Оба сценария приводят к избыточному и неправильному использованию противомикробных препаратов, что способствует неудачам в лечении, оппортунистическим инфекциям, таким как C. difficile, и появлению резистентных к антибиотикам организмов.
С внедрением культурально-независимых методов, таких как метагеномное секвенирование следующего поколения (mNGS), ограничения в диагностике сепсиса могут быть преодолены. Последние достижения в области внеклеточного секвенирования ДНК плазмы расширили сферу применения метагеномной диагностики, обеспечив возможность минимально инвазивного обнаружения циркулирующей нуклеиновой кислоты патогенов, происходящих из анатомически различных мест инфекции. Однако клиническое воздействие метагеномики плазменной ДНК было поставлено под сомнение из-за частой идентификации микробов с неопределенной клинической значимостью, неспособности обнаружить РНК-вирусы, вызывающие пневмонию, и ограниченной полезности для исключения наличия инфекции.
Транскрипционное профилирование цельной крови потенциально может смягчить эти ограничения путем сбора сигнатур экспрессии генов хозяина, которые отличают инфекционные состояния от неинфекционных и вирусные инфекции от бактериальных. Однако, поскольку транскрипционное профилирование фиксирует исключительно ответ хозяина на инфекцию, оно не обеспечивает точной таксономической идентификации возбудителей сепсиса, что ограничивает полезность этого подхода при самостоятельном применении. Кроме того, транскрипционное профилирование традиционно требует выделения мононуклеарных клеток периферической крови или стабилизации цельной крови в специализированных пробирках, и до сих пор остается неизвестным, может ли простой образец плазмы дать информативные данные для диагностики инфекционных заболеваний на основе данных хозяина.
В недавней работе для улучшения диагностики инфекций нижних дыхательных путей был разработан метагеномный подход, сочетающий транскрипционное профилирование хозяина и беспристрастное выявление патогенов. Сепсис, определяемый как "угрожающая жизни дисфункция органов в результате дисрегуляции реакции хозяина на инфекцию", представляет собой дополнительный очевидный случай использования этого интегрированного метагеномного подхода хозяин-микроб.
В данном исследовании мы изучили проспективную когорту тяжелобольных взрослых для разработки диагностического анализа сепсиса, который сочетает в себе транскрипционное профилирование хозяина и идентификацию патогенов широкого спектра. Применяя машинное обучение к многомерным данным mNGS, мы оценили особенности хозяина и микроорганизмов, которые отличают микробиологически подтвержденный сепсис от неинфекционного критического заболевания. Затем мы продемонстрировали, что нуклеиновые кислоты плазмы могут быть использованы для профилирования как хозяина, так и микроорганизма для точной диагностики сепсиса.
Мы провели интегрированное метагеномное секвенирование РНК и ДНК следующего поколения (mNGS) цельной крови (n = 221) и плазмы (n = 138) тяжелобольных пациентов после госпитализации. Мы распределили пациентов по группам сепсиса на основании клинических и микробиологических критериев. По данным экспрессии генов в цельной крови мы отличали пациентов с сепсисом от пациентов с неинфекционными системными воспалительными заболеваниями с помощью машинного обучения. РНК плазмы также дала транскрипционную сигнатуру сепсиса, включающую несколько генов, о которых ранее сообщалось как о биомаркерах сепсиса.
Эффективность обнаружения патогенов mNGS плазмы варьировала в зависимости от патогена и места инфекции. Для улучшения обнаружения вируса мы разработали вторичный транскриптомный классификатор. Мы объединили признаки хозяина и микроорганизмов для разработки интегрированной модели диагностики сепсиса, которая позволила выявить 99% случаев сепсиса, подтвержденных микробиологически, и предсказать сепсис в 74% случаев подозрения и 89% случаев неопределенного диагноза сепсиса.
Определение этиологического агента имеет решающее значение для оптимального лечения сепсиса. Мы установили, что совпадение между выявлением возбудителя с помощью mNGS плазмы и традиционного бактериального посева крови зависит от конкретного организма. Например, чувствительность mNGS для выявления S. aureus и E. coli, двух наиболее глобально важных возбудителей сепсиса, составила 100%. Напротив, mNGS пропустил несколько важных, но менее распространенных возбудителей сепсиса, таких как S. pyogenes. Мы отметили, что во всех ложноотрицательных случаях пациенты принимали антибиотики до взятия образцов mNGS, и что исследование образцов mNGS, взятых через 24 часа после взятия культур крови, могло привести к более низкой конкордантности, чем если бы образцы были взяты одновременно.
Некоторые из микроорганизмов, пропущенных при проведении mNGS, были организмами, которые во многих контекстах существуют как комменсалы (например, виды Fusobacterium, Gemella и Streptococcus). Неясно, были ли эти организмы действительно возбудителями этиологического сепсиса или комменсалами, транслоцированными в кровь в условиях критического заболевания и случайно выявленными в культуре. Что касается сепсиса, не связанного с ИБС, наши результаты показывают, что mNGS плазмы может быть наиболее полезным для выявления патогенов, связанных с инфекциями кровотока (ИК), хотя мы также наблюдали некоторую полезность для выявления респираторных патогенов, в соответствии с предыдущими сообщениями. mNGS не смог обнаружить C. difficile ни у одного пациента с колитом, вызванным этим патогеном, хотя это неудивительно, учитывая, что этот организм редко ассоциируется с бактериемией.
В группе без сепсиса у 10/37 (27%) пациентов с помощью mNGS были обнаружены возбудители. Примечательно, что 9/10 (90%) патогенов были грамотрицательными энтеральными организмами, что может отражать желудочно-кишечную транслокацию микробов, хорошо описанное явление во время критического состояния. Кроме того, все 10 пациентов принимали антибиотики в первый день после включения в исследование, поэтому возможно, что сиквенсы были получены из нежизнеспособных организмов, не способных расти в культуре.
Секвенирование РНК плазмы само по себе показало низкую эффективность для выявления респираторных вирусов, ассоциированных с сепсисом. Однако включение вирусного классификатора на базе хозяина значительно улучшило выявление клинически подтвержденных вирусных инфекций нижнего респираторного тракта. Вирусный классификатор предсказал ранее нераспознанные вирусные инфекции у трех пациентов с сепсисом, которые не проходили ПЦР-тестирование на вирусы во время госпитализации. Предыдущие работы показали, что различные виды вирусов вызывают различные транскрипционные сигнатуры хозяина в периферической крови, что позволяет предположить, что будущие исследования могут расширить вирусный классификатор РНК-хозяина для идентификации конкретных вирусов, таких как грипп или SARS-CoV-2.
В соответствии с предыдущими сообщениями, мы обнаружили, что вирусный сепсис имеет уникальную транскрипционную сигнатуру хозяина, характеризующуюся экспрессией интерферона и других сигнальных путей. Мы также наблюдали транскрипционные различия в зависимости от того, был ли сепсис вызван инфекцией кровотока или периферического участка, что было менее ожидаемо: у пациентов с ИК наблюдалась более низкая экспрессия генов, связанных с сигнализацией CD28 и активацией Т-клеток, и более высокая экспрессия генов, связанных с антимикробными пептидами и дефенсинами.
Мы выяснили, что обнаружение только патогена во многих случаях недостаточно для диагностики сепсиса, но в сочетании с транскрипционным профилем хозяина имеет многообещающую диагностическую ценность и потенциал в качестве инструмента для исключения инфекции. В дополнение к определению сигнатур сепсиса по цельной крови, мы также обнаружили биологически значимые транскрипты хозяина в плазме. Это может иметь прямое клиническое применение, учитывая, что плазменная mNGS все чаще используется в клиниках для обнаружения патогенов у пациентов с сепсисом и другими инфекционными заболеваниями, при этом время выполнения анализа составляет ≤48 ч.
Неправильное применение противомикробных препаратов является одной из основных проблем при лечении критических заболеваний и часто обусловлено невозможностью исключить инфекцию у пациентов с системными воспалительными заболеваниями. Действительно, мы обнаружили, что только клинические переменные, включая оценку по шкале qSOFA, не могли точно отличить пациентов с сепсисом от пациентов с неинфекционными критическими заболеваниями во время первичной оценки в ОРИТ. В отличие от этого, наша доказательная оценка интегрированной модели mNGS "хозяин + микроб" продемонстрировала 99% чувствительность среди пациентов с микробиологически подтвержденным сепсисом и 78% специфичность в группе "без сепсиса", которая почти полностью состояла из пациентов, соответствующих клиническому определению синдрома системного воспалительного ответа.
mNGS хозяин/микроб может способствовать прецизионному управлению антимикробными препаратами, отличая сепсис от различных типов неинфекционных лихорадочных воспалительных синдромов, начиная от аутоиммунных заболеваний и заканчивая синдромом активации макрофагов. Мы предполагаем, что этот анализ будет использоваться при поступлении в отделение реанимации для всех пациентов с подозрением на сепсис в качестве дополнения к посеву крови и другим традиционным микробиологическим исследованиям.
Отличить истинных возбудителей сепсиса от контаминантов из окружающей среды или комменсалов человека - сложная задача как для mNGS, так и для традиционных культуральных микробиологических методов. Сопутствующая оценка показателей на основе хозяина дает возможность определить, существует ли обнаруженный патоген в контексте иммунологического состояния, соответствующего инфекции. Учитывая это, теоретически диагностическая классификация mNGS по принципу хозяин/микроб может быть более сложной у иммунокомпрометированных пациентов. Однако в качестве аргумента против этого приводится предыдущая работа, демонстрирующая точное выполнение диагностики пневмонии с помощью mNGS "хозяин/микроб" в когорте пациентов отделения интенсивной терапии с 40%-ной распространенностью иммунокомпрометированных лиц.
Наше исследование имеет ряд преимуществ, включая инновационное использование транскриптомики РНК плазмы для диагностики сепсиса, разработку диагностики сепсиса, объединяющей данные mNGS хозяина и микроорганизмов, подробное клиническое фенотипирование и большую проспективную когорту тяжелобольных взрослых с системными заболеваниями. Оно также имеет некоторые ограничения. Во-первых, как отмечалось выше, mNGS и посевы крови проводились на разных образцах, собранных в разное время, поэтому наблюдаемая согласованность с клиническими микробиологическими исследованиями может быть заниженной. Во-вторых, в нескольких образцах плазмы было недостаточно транскриптов хозяина для проведения анализа экспрессии генов, что привело к меньшему размеру выборки для плазмы по сравнению с когортами цельной крови. Это ограничение может быть устранено в будущих исследованиях путем увеличения количества исходной РНК плазмы.
Иммунный ответ хозяина во время сепсиса является динамичным, поэтому стадия инфекции, на которой измеряется экспрессия генов, может повлиять на точность классификатора. Хотя наше исследование было перекрестным по дизайну, мы попытались проконтролировать это путем отбора образцов на ранней стадии критического заболевания, в течение первых 24 часов после поступления в отделение интенсивной терапии. Наконец, поскольку у нас не было доступа к другим исследованиям сепсиса с данными экспрессии генов в плазме или парными данными mNGS хозяина и микроорганизмов из крови, для подтверждения этих результатов потребуются дополнительные исследования в независимой когорте.
В заключение мы сообщаем, что сочетание профилирования экспрессии генов хозяина и метагеномного выявления патогенов по нуклеиновым кислотам плазмы позволяет точно диагностировать сепсис. Необходимы дальнейшие исследования для подтверждения и проверки клинического эффекта этого культурально-независимого диагностического подхода.
